Monografias | Microscopía confocalMicroscopía confocalResumen: El Microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas: un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de Emisión(E) 2.
Factores que influyen en la obtención de una buena
imagen 3.
Usos 4.
Fluorocromos El
Microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas: -
un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del
fotodetector, denominado Pinhole de Emisión
Manuel
Reina , Univ. deBarcelona
(http://www.ub.es/biocel/wbc/images/fluorescencia/clsm.jpg)
-
Alta precisión y velocidad en el barrido -
Pinhole continuamente variable -
Resolución hasta los 2048 x 2048 pixeles -
Controles independientes del PMT, amplificadores, filtros y
configuraciones. -
Un detector y un pinhole por canal -
Un filtro optoacústico para el control de cada láser -
Disminución del ruido -
Escaneos seriados para la realización del objeto en 3D -
expresión y localización de moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo
reconstrucciones tridimensionales, tanto en cultivos celulares como tejidos
histológicos; -
estudios de colocalización de proteínas u otro tipo de moléculas; -
transporte intracelular, endocitosis; -
medidas de concentraciones de iones intracelulares; -
desarrollo y expresión génica; -
hibridación in situ con sondas fluorescentes; Los
fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una
longitud de onda determinada cuando captan (son exitados) por un fotón
incidente de una longitud de onda característica. Uno
de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de
fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz
empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante
largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia
('fluorescence fading'). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este
efecto, entre ellos destacan : ·
el uso de reactivos
protectores de la fluorescencia ('antifading reagents') ·
el uso de fluorocromos con
poco 'fading' ·
el empleo de luz de excitación
de menor intensidad ·
la reducción de la
concentración de oxígeno en el especimen ·
el direccionamiento del 100%
de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,...) para reducir
al máximo el tiempo de exposición. ·
el empleo de mecanismos de
medición de la exposición óptima (automática) para reducir la iluminación
al máximo. Los
reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos
electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas
donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha
vecindad a las moléculas de fluorocromo. Los
reactivos antifading más empleados son los siguientes : ·
p-phenylenediamine. Es el
reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la fluoresceína
(FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en
la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso. ·
DABCO
(1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque
menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico.
·
n-propyl galeate. Es el agente
más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína.
Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. ·
2-mercaptoethylamine. Se
emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñinas con ioduro
de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se
emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA. ·
Colorantes
más utilizados – Rangos de emisión: Table
of Fluorochromes
(And possible use with Ar/Kr lasser) Probe Ex
(nm) Em
(nm) Notes Hydroxycoumarin 325 386 Succinimidyl
ester Aminocoumarin
(AMCA) 350 445 Succinimidyl
ester Methoxycoumarin 360 410 Succinimidyl
ester R-Phycoerythrin
(PE) 480;565 578 Fluorescein 495 519 FITC Alexa
350 350 450 Alexa
430 430 530 Alexa
488 488 519 Alexa
568 568 610 Alexa
594 594 610 BODIPY-FL 503 512 Rhodamine
(TRITC) 547 572 Texas
Red 589 615 Sulfonyl
chloride Cy2 488 515 Cy3 512;552 565,615 Cy5 625;650 670 Cy7 743 767 X-Rhodamine 570 576 XRITC Tetramethylrhodamine 550 590 Lissamine
Rhodamine B 570 590 PerCP 490 675 Peridinin
chlorphyll protein Allophycocyanin
(APC) 650 660 PE-Cy5
conjugates 480;565;650 670 Tri-Color,
Quantum Red PE-Cy7
conjugates 480;565;743 767 Red
613 480;565 613 PE-Texas
Red TruRed 490,675 695 PerCP-Cy5.5
conjugate Cascade
Blue 375;400 423 Hydrazide Lucifer
yellow 425 528 APC-Cy7
conjugates 650;755 767 Hoechst
33342 343 483 DNA
(fixed cells) DAPI 345 455 DNA
(fixed cells) Hoechst
33258 345 478 DNA
(for live and fixed cells) SYBR
green 488 509 DNA Propidium
Iodide + RNAse 536 617 DNA
only TO-PRO-3 642 661 DNA Mithramycin,
Chromomycin A3 445 575 Thiazole
Orange 453 480 SYTO
13 488 509 DNA+RNA;
For live Cells. SYBR+A59r
green 488 509 Ethidium
Bromide 493 620 DNA/RNA Acridine
Orange 503 530/640 DNA/RNA TOTO-1,
TO-PRO-1 509 533 Vital
stain DNA/RNA Propidium
Iodide (PI) 536 617 DNA/RNA TOTO-3 642 661 SYTO
59 640 660 DNA+RNA
for Live Cells Indo-1 361/330 490/405 AM
ester. Low/High Ca++, Fluo-3 506 526 AM
ester. pH > 6 2'7'Dichorodihydrofluorescein
(DCFH) 505 535 Oxidized
form Dihydrorhodamine
123 (DHR) 505 534 Oxidized
form. Light catalyzes oxidation Calcein 496 517 pH
> 5 Monochlorobimane 380 461 Glutathione
probe SNARF 548;579 587/635 pH
6/9 Fluorescent
Proteins (expression markers) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
