Monografias | Determinación de anticuerpos antiepidérmicos por inmunofluorescencia indirecta parael estudio de colagenopatías autoinmunes

RESUMEN
Las colangiopatías autoinmunes forman un variado grupo de enfermedades que afectan los músculos, huesos y piel. Dentro de este grupo se encuentran el Lupus Eritematoso Discoide (LED) y el Sistémico (LES), el Síndrome de Sjögren (SS), la Esclerodermia y la Dermatomiositis, por citar algunos ejemplos y ser las enfermedades que se escogieron para el estudio.

En el presente trabajo se realizó una estandarización de la técnica de detección de anticuerpos antiepidérmicos séricos por Inmunofluorescencia indirecta (IFI) para el diagnóstico de colangiopatías autoinmunes, utilizando un conjugado fluorescente con actividad anti-inmunoglobulina G humana.

Se determinó la dilución serológica óptima (1/10) para la incubación sobre el sustrato antigénico; tiempo de incubación óptimo con la dilución serológica (30 min.) y el conjugado fluorescente (45 min.), además de estudiar la Sensibilidad y Especificidad de los anticuerpos anti-epidérmicos (70% y 80 % respectivamente) para el diagnóstico de las enfermedades estudiadas; mientras que el estudio de los parámetros inmunológicos revelaron resultados de hipergammaglobulemia, disminucion del sistema complemento y alteraciones en la proteína C reactiva, como era de esperar en estos pacientes aquejados con Lupus eritematoso disciode . 

Palabras claves: anticuerpos antiepidérmicos, inmunofluorescencia indirecta, colagenopatías autoinmunes, hipergammaglobulemia. 

Title: Antibodies antiepidermic detecction for indirect inmunolfuorescence for te diagnostic of autoinmune collagen deseases.
Abstract:
Autoimmune colagen-related pathologies comprise a varied group of illnesses which affect muscles, bones and the skin. Within this group, we may include: Discoid Lupus Eritematosus (DLE), Systemic Lupus Erythematosus (SLE), Sjögren Syndrome (SS), sclerodermia, dermatomiositys; lichen planus and pemphigus .
In the current paper it was carried out a standarized study of the technique of detection of anti-epidermic antibodies in serum, using indirect immunofluorescence (IIF) for the diagnosis of auto-immune colagen-involved diseases, using a fluorescent conjugated reagent with human G anti-immunoglobulin. 

The optimal dilution in serum was determined (1/10) for the incubation on the antigenic platform with an p= .2301; the time of optims incubation with serum was 30 min and p= .0464 and time optims incubation whit fluorescent conjugated report 45 min with p= .007. Althout from studying the sensitivity and specificity of the anti-epidermic antibodies (75% and 63% respectively) for the diagnosis of the studied diseases. The inmunologic parameters concentration was found higth in the mayority of the patients. It´s evidence the presence of the complement system activation, hipergammaglobulemy, CRP in the colagen-ralated disease, principality LED. 

Key words: antiepidermis antibodies, indirect inmunofluorescence, autoinmune colagen pathologys.

INTRODUCCION
En las enfermedades autoimunes del colágeno existen alteraciones inmunológicas en la dermis, con infiltraciones linfocitarias y presencia de autoanticuerpos, principalmente anti-epidérmicos (ASA) dirigidos contra la membrana basal, formando las llamadas bandas lúpicas, por su disposición a todo lo largo de la membrana epidermo-dermal en las lesiones cutáneas (1,2,3,10,11,12)

Los anticuerpos anti-epidérmicos fundamentalmente son de clase IgG, aunque se pueden encontrar IgM e IgA y factores del complemento C3 (con acción similar a las IgG), C5a y los elementos del complejo de ataque a la membrana MAC (C6-C9). (1,3,5,6,10,11)

La introducción de esta técnica en el Hospital Clínico Quirúrgico “Lucía Iñiguez Landín” para la detección de anticuerpos antiepidérmicos por inmunofluorescencia indirecta (IFI) situaría el nivel diagnóstico de las colagenosis en nuestro Centro a la altura de las Instituciones Nacionales en las que se realizan los diagnósticos de estas enfermedades por inmunofluorescencia directa (IFD). Esto significaría una mejor atención a pacientes por prescindir de biopsias para el estudio, pues solo con la extracción de la sangre periférica es suficiente para aislar los anticuerpos y se obtienen varios patrones de fluorescencia que se diferencian fácilmente, pudiéndose usar varios sustratos antigénicos (cortes de esófago de rata, mono y conejo). (11,13). Además es una técnica poco costosa, las antiinmunoglobulinas (en nuestro caso IgG) se obtienen por inmunización de carneros en muy poco tiempo y con pocos recursos.

Consideramos que con la estandarización de la técnica de detección de anticuerpos antiepidérmicos (ASA) por inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la utilización de criosecciones de esófago de rata de la línea Wistar y el conjugado fluorescente con actividad antiinmunoglobulina G (anti-IgG) humana, se obtendrá un mejor diagnóstico diferencial en pacientes aquejados por las colagenopatías autoinmunes estudiadas, con los mismos valores reportados por la literatura.

OBJETIVO GENERAL
En el presente trabajo se realiza la estandarización de la técnica de detección de anticuerpos antiepidérmicos séricos por IFI para el diagnóstico de las colagenopatías autoinmunes, utilizando un conjugado fluorescente (anti-IgG) humana.
Para esto ha sido necesario:
- Determinar la dilución serológica óptima para la incubación sobre el sustrato antigénico; tiempo de incubación óptimo con la dilución serológica y el conjugado fluorescente.
- Determinar la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos anti-epidérmicos para el diagnóstico de las enfermedades estudiadas. 
- Analizar la relación de los anticuerpos antiepidérmicos con otros autoanticuerpos. 
- Estudiar algunos parámetros inmunológicos asociados a estas patologías autoinmunes.

MATERIALES Y METODOS
Para este estudio se utilizaron 62 sueros controles positivo de pacientes con enfermedades autoinmunes del colágeno, (16 sueros de LED, 9 sueros de LES, 5 de SS, 7 de esclerodermia, 4 sueros de dermatomiositis, 11 sueros de liquen plano y 10 sueros de pénfigo, ya diagnosticadas, procedentes de las Consultas externas de las Especialidades de Dermatología, Inmunología y Reumatología del Hospital Lucía Iñiguez Landín. Los 20 sueros controles negativos fueron tomados del Banco de Sangre Provincial de Holguín donde no se detectaron autoanticuerpos.

El conjugado anti-IgG humana marcado con Isotiocianato de fluoresceína, fue sintetizado en el laboratorio de Inmunología de la misma Institución según “Normas para la conjugación de sueros hiperinmunes con Isotiocianato de fluoresceína” del Centro de Inmunología y Biopreparados de la Provincia de Holguín. (3,5,6,7,8,15,16)

Los cortes de esófago e hígado de rata de la línea Wistar, usados como sustratos antigénicos para la detección de los anticuerpos antiepidérmicos, antiqueratina (AKA) y los antinucleares (ANA) respectivamente, fueron realizados por el LABEX, Santiago de Cuba.

Para la cuantificación de IgG e IgM se usó un agar con antiinmunoglobulinas IgG e IgM por la técnica de radioinmuno difusión simple.

Los reactivos químicos utilizados proceden de firmas comerciales (Riedel-deHaën. Sigma-Aldrich, Germany; Panreac. MONTPLET & ESTEBAN SA, España; AnalaR. BDH Chemicals Ltd Poole, England; MERCK. E. Merck, Darmstadt.) y poseen grados de pureza para análisis de laboratorio (RA).

Los reactivos utilizados (CRP, C4, C3c, RF-II) para las determinaciones inmunológicas de las muestras estudiadas proceden de firmas comerciales Roche/Hitachi Guatemala, SA.

METODOS
Para determinar la dilución serológica patrón, y el tiempo de incubación con el sustrato antigénico, se usaron 8 sueros (16 total) de LED (por ser la patología más representativa, en cuanto a la presencia de ASA específicos y no presentar una gran variedad de autoanticuerpos como en el pénfigo y en el liquen plano) con diluciones seriadas de 1/10 hasta 1/160, cada uno con tres réplicas, y 5 controles negativos con una réplica para cada muestra, incubados en cortes histológicos de esófago de rata. Se fijó como tiempo de incubación del conjugado fluorescente el referido por la literatura (45 min).

En la determinación del tiempo de incubación del sustrato-anticuerpo antiepidérmico con el conjugado fluorescente se usaron los mismos sueros positivos de la determinación anterior. Los tiempos de incubación variaron desde 30 hasta 90 min. escogiéndose como referencia los valores que normalmente se utilizan en la técnica universal de inmunofluorescencia.

La sensibilidad y especificidad clínica de los ASA se estudió detectando los mismos, además de ANA y AKA en las muestras de LED, LES, SS, esclerodermia, dermatomiositis, liquen plano, pénfigo y en los controles negativos. Los por ciento de sensibilidad y especificidad de la técnica se realizó por la relación: (18,19,20)

Sensibilidad: (a / a + c) x 100 donde a: valores positivos con LED
c: valores negativos con LED
Especificidad: (d / d + b) x 100 donde d: valores negativos sin LED
b: valores positivos sin LED

Se determinó la presencia de los ANA, AKA por IFI y FR por micrométodo utilizando un autoanalizador Roche/Hitachi, de las muestras de los pacientes con estas enfermedades diagnosticadas que tenían ASA detectados por la misma técnica.

La cuantificación de las fracciones C3c y C4 del Sistema Complemento y la Proteína C Reactiva (PCR) se realizó por micrométodo usando el autoanalizador Roche/Hitachi.

La cuantificación de IgG e IgM séricas mediante inmunodifusión radial simple, según “Manual Técnico de Inmunología”. 

El estudio estadístico entre los diferentes parámetros a estandarizar se realizaron por comparación de proporciones usando un Paquete estadístico Microsta (1984). Ecosoft. El estadígrafo c2 nos sirvió para determinar las diferencias entre las diluciones serológicas, los tiempos de incubación con el suero del paciente y el conjugado fluorescente; así como la relación entre los autoanticuerpos estudiados.

ANALISIS Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
El patrón de fluorescencia de los ASA en los cortes de esófago de rata, en las muestras con LED, se observó principalmente en forma fibrilar o laminar a todo lo largo de la membrana basal, cubriendo los estratos espinoso y córneo del tejido (10,11,13,20,22,25,26), en el corte histológico de esófago de rata de la línea Wistar, aunque en algunos cortes se observaron patrones fluorescentes granulares, y ninguna muestra positivó con patrones homogéneos (10,11,13,18,20,26). En muchos casos se observó fluorescencia en el estrato espinoso, emitiendo luz verde entre los espacios intercelulares con patrones laminares característicos. (10,11,13) 

Se mostró positividad hasta la dilución serológica 1/80, mientras que en la dilución 1/160 no se emitió luz verde. La fluorescencia laminar, en comparación con otras diluciones mayores, fue escasa para 1/80, esta última positivó muy tenue (grado I) preferentemente a tiempos máximos de incubación con el conjugado anti IgG humana. 

Sin embargo, en la dilución 1/40, expresó mayor cantidad de réplicas positivas con grado I y II, con relación a la dilución 1/80; mientras que el tratamiento con las diluciones 1/10 y 1/20, para todas las réplicas, mostró positividad de grado III y muy pocas de grado II

Para los tres tiempos de incubación serológica usados, se observó fluorescencia, pero transcurridos 45 y 90 min. se encontraron patrones moderadamente interferidos por fluorescencia inespecífica no así para 30 min., en este último la fluorescencia se observó nítida. 

Los sueros incubados con el conjugado fluorescente a 30 min. mostraron patrones positivos de grado I, pero con fluorescencia amortiguada; en los casos tratados con 90 min. se observaron patrones positivos de grado II y III, aunque con mucha interferencia; mientras que con 45 min. no existió fluorescencia inespecífica y se mostraron los patrones positivos con una alta nitidez, siendo éste el tiempo óptimo de acople de los anticuerpos correspondiendose con los valores de la literatura.

Las diferentes diluciones se compararon estadisticamente tomando como referencia la dilución 1/10,la cual resulto la optima para el trabajo con estos autoanticuerpos. (16,19) 

Se encontro diferencias significativas entre los tratamientos con diluciones 1/40 y 1/80, con probabilidades de 0.0014 y 0.0037 respecitvamente; mientras que con la dilucion 1/20 no se encontro diferencias sinificativas con una probabilidad de 0.2301. Teniendo en cuanta los resultados anteriores, es posible emplear las diluciones 1/10 y 1/20 como óptimas para el trabajo; sin embargo, se escoge la primera para poder realizar mayores diluciones y un mejor estudio de las concentraciones de los autoanticuerpos.

La comparación entre los diferentes tiempos de incubación de la muestra serologica sobre el sustrato, demostró que existen diferencias sinificativas entre los tiempos de incubacion 30-90 min con una p= 0.003; mientras que entre 30-45 min no existio diferencias sinificativas con una p=0.0464, pero se toma el tiempo de 30 min para evitar exposiciones prolonadas de los anticuerpos e inespecificidades en la fluorescencia. 

El tiempo de incubacion con el conjugado fluorescenete se comparó entre los valores de 45-30 min donde la p=0.004 reportando diferencias sinificativas; mientras que entre 45-90 min no se observaron diferencias con una p= 0.007. Se escoge 45 min como tiempo de incubación óptimo del complejo sustrato-anticuerpo antiepidérmico con el conjugado fluoresceínado, pues valores mayores existe la interferencia de fluorescencia inespecífica y a valores menores, la luz verde emitida se observa algo amortiguada en comparación con el tiempo seleccionado. Este valor coincide con lo referido por la literatura. 

En las investigaciones realizadas se encontraron que de 16 pacientes diagnosticados como enfermos de LED, 12 de ellos mostraron positividad para los anticuerpos antiepidérmicos con patrones laminares y granulares de grado II y III; 4 no emitieron fluorescencia. El grupo que comprende las otras enfermedades (tratados con los mismos sustratros) incluyen a: 3 sueros de LES, 1 de SS, 2 de esclerodermia, 1 sueros de dermatomiositis, 5 sueros de liquen plano y 5 sueros de pénfigo, tuvieron patrones laminares de grado I y II; el resto, al igual que los controles negativos (exceptuando uno de ellos para el FR, lo que pueda deberse a la exposición del donante frente una infección estreptocócica en días anteriores a la toma de muestra ), no presentaron positividad, lo que se corresponde con un 75% de sensibilidad y 63% de especificidad.(Tabla 1). Los valores de referencias bibliográficos encontrados que reportan los valores de especificidades de los anticuerpos antiepidérmicos para el LED son de 60 a 70 % (10,11) encontrándose nuestros valores dentro del rango comprendido por la literatura. 

Tabla.1. Estudio de la sensibilidad y especificidad clínica de los anticuerpos antiepidérmicos en comparación con otros autoanticuerpos. El mayor por ciento de sensibilidad y especificidad se corresponde a los anticuerpos antiepidérmicos, lo que le confiere las características de ser marcadores serológicos del LED. 


Los ANA generalmente no muestran positividad en el LED, aunque se han reportados valores de un 35% para los anti-DNAss, siendo casi nula la presencia de los anti-DNAds. (12,13,19,20)

Como se demuestra, hay una mayor sensibilidad y especificidad para los AKA como marcadores diagnósticos que en los ANA. No se encontraron valores de referencia de estos anticuerpos en la literatura, pero son los que normalmente se realizan en la mayoría de las Instituciones Hospitalarias como diagnósticos diferenciales de las colagenopatías. 

Relacion de los ASA con los ANA, AKA y antieritrocitos. 
En las 12 de las 16 diluciones serológicas pertenecientes a pacientes con LED diagnosticada, se detectaron anticuerpos antiepidérmicos; de éstas, solo 2 emitieron luz verde sobre los cortes de hígado de rata propios de los ANA. Mientras que, de las soluciones serológicas que no expresaron anticuerpos antiepidérmicos, solo 1 de ellas positivó con el patrón descrito anteriormente, pero con grado I.

De la misma cantidad de muestras positivas para antiepidérmicos, 6 resultaron fluorescentes para el sustrato de esófago de rata y 6 no emitieron fluorescencia; mientras que los restantes 4 pacientes con antiepidérmicos negativos no positivaron frente al sustrato antigénico para AKA. Lo mismo sucedió con los antieritocitos en estas muestras.

Determinacion de los parametros inmunologicos realcionados con las colagenopatias estudiadas.
De las 12 muestras con LED estudiadas para C3, 11 resultaron con concentraciones muy por debajo de los valores de referencia (0.9-1.8 g/L) (22), encontrándose en un rango de 0.32 - 0.91 g/L, evidenciándose una activación de este componente.

Al igual que el componente C3 tuvo muy poco incremento en la mayoría de las 12 muestras investigadas. De ellas 8 se encontraron en un rango por bajo de los valores de referencia (0.1-0.4 g/L) (22), comprendido entre 0.04-0.09 g/L, también evidenciándose la activación de este componente y la presencia en la zona epidermo-dermal de la membrana basal. 

De las 12 muestras estudiadas, con anticuerpos antiepidérmicos positivos, 9 alteraron la PCR, con valores comprendidos entre 0.005-0.020 g/L , por encima del valor normal ( ≤ 0.005 g/L) (22), lo que indica la presencia de signos inflamatorios en estos pacientes con LED; mientras que los restantes 3 tuvieron esta proteína normal (0.003-0.004 g/L) Esto pudiera deberse a que no estuvieran en un estadio agudo de la enfermedad.

En nuestros experimentos se observó una hipergammaglobulemia de la IgG en 10 muestras de las 12 procesadas, que se comprendían entre 20 y 35 años de edad.

El rango se movió entre 16-27 g/L, muy por encima de los valores de referencia normales (6.79-15.37 g/L)(18). Esto afirma la presencia de altas concentraciones de IgG en estos pacientes con anticuerpos antiepidérmicos positivos, ubicados en la membrana basal (zona epidermo-dermal) (10,11) y la positividad de los patrones fluorescentes obtenidos en nuestro estudio, que corresponden a estos autoanticuerpos. 

Las dos muestras restantes con valores normales (10 g/L y 14 g/L) quizás se deba a que estos pacientes no estuvieran en estado agudo de la enfermedad.

Las concentraciones de IgM se comportaron muy similar a las de IgG, aunque con un número menor de muestras (7 de 12) cuyos valores se comprendieron entre (6.0-9.2 g/L) por encima de los rangos de referencia (0.33-2.29 g/L). El número de muestras, no muy alto, con concentraciones elevadas, quizás se deba a que la mayoría de los autoanticuerpos antiepidérmicos sean de la clase IgG y no IgM, aunque se han observado patrones fluorescentes característicos para estos anticuerpos, pero en pocas ocasiones. Las cuatro muestras con concentraciones normales de IgM (4.8-5.8 g/L), también puedan deberse a lo planteado para las IgG, sobre la agudez de la enfermedad.. 

CONCLUSIONES
1. La dilución óptima que se determinó para el acoplamiento de los ASA al sustrato fue de 1/10, lo que indica que a este título se encuentran la mayor cantidad de anticuerpos que realizan interacciones efectivas con el antígeno histológico sin interferencia inespecífica e incubado durante 30 min, y 45 min con el conjuado fluorescencte.
2. La detección de los ASA por IFI reportó una sensibilidad y especificidad de 75% y 63%, respectivamente, lo cual avala al método como útil para el diagnóstico del LED y otras colagenosis, en comparación con la sensibilidad y especificidad de la determinación de ANA y AKA por el mismo método.
3. En la relación de los ASA y AKA no se encontraron diferencias sinificativas, lo que indica que en mismo paciente aquejado con LED o cualquier otra calagenopatia pudiera estar presentes ambos anticuerpos como marcadores serológicos; mientras que entre los ASA con los ANA y FR, a pesar de no haber existido diferencias sinificativas estadisitcamente, estos generalmente no se encuentran presentes en estas enfermedades autoinmunes.
4. Los niveles de concentración de los parámetros inmunológicos (C3c, C4, PCR, IgG, IgM) se encontraron elevados en la mayoria de los pacientes estudiados, lo que evidencia la presencia de la activación del complemento, signos inflamatorios e hipergammaglobulemia en las colagenopatias autoinmunes, especialmente en el LED.
5. La detección de ASA por IFI en pacientes con calagenopatias autoinmunes, permitió estandarizar un método para el diagnóstico diferencial de estas enfermedades, ajustados a las condiciones de nuestro método.

BIBLIOGRAFIA
1. Faimbon G, Satz ML. Introducción a la Inmunología humana. Talleres Gráficos Patricia. Argentina. 1998
2. Roitt Ivan, Brostoff Jonathan, Male David. Inmunología. segunda edición. Ed Revolucionaria, La Habana.1991
3. Robbins Stanley L. Patology. 3 edition. Ed. W.B.Sauder Company. 1986. 
4. Farreras Rozman. Tratado de Medicina Interna. décimotercera edición. Edición CD-Rom. 2002
5. Bennett J Claude, Plum Fred. Tratado de Medicina Interna. CECIL. Vol II. 20 edición.1998
6. Stites Daniel, Terr Abba. Inmunología humana y básica. primera edición. Ed. Manual Moderno. 1994
7. Abbas Abul K, Lichtman AH, Pober S.S. Inmunología Celular y Molecular. Ed. Interaméricana. España.2000
8. Vallage G. Manifestaciones clínicas del Lupus Eritematoso Discoide. 2002.Disponible en: http://www.nlm.nih.gov/ medlineplus/spanish/ency/esp. 
9. Robbins Stanley L, Cotran Ramzi S, Kumar Vinay. Patología Estructural y Funcional. Tomo I. quinta edición. Editorial Mc Graw- Hill. Interamericana de España.1996
10. Freedberg Irvin M, Eisen Arthurs Z, Klaus Wolff. Fitzpatrick´s. Dermatology in General Medicine. Vol II. 6 edition. Ed. Mc Graw-Hill. 2003.
11. Fitzpatrick Thomas B, Freedberg Irvin M, Eisen Arthurs Z, Klaus Wolff. Dermatología en Medicina General. Textos y Atlas. Tomo II. segunda edición. Ed. Médica Panamericana S.A. 1980.
12. Miler D, Hotner H. Lupus Eritematoso Discoide, principales afectaciones . 2001.Disponible en: http://www.medynet.com/ elmedico/aula2001. 
13. Colectivo de autores. Catálogo sobre inmunofluorescencia indirecta. Biosystems Reagents & Instruments. 2003.
14. Roca Goderich, Reynaldo. Temas de Medicina Interna. tercera edición. Ed. Pueblo y Educación. 1994.
15. Bennett J Claude, Plum Fred. Tratado de Medicina Interna. CECIL. Vol I. 20 edición.1998
16. Ferrandiz, Carlos. Dermatología Clínica. novena edición. Ed. El Manual Merck de diagnóstico y terapéutica.1996.
17. Robbins, Stanley L. Patology basic of disease. 1 edition. Ed. W.B.Sauder Company. 1974.
18. Ballester G, Moreno H. Manifestaciones del Lupus Discoide Eritematoso.2003.Disponible en: http://www.galderman.com.mx/ 
19. Deller M, Mannerile, E. Autoimune Diseases. Discoid Lupus Erythematosus.2003.Disponible en: http://www.biocientifica.com/ .
20.Colectivo de autores. Discoid Lupus Erythematosus. The Merck Manual of Diagnostic and therapy. 2003. Disponible en: http://www.merck.com/ 
mrk.shared/mmanual/section5/.
21. Grand, JM. Lupus Eritematoso Ampolloso asociado a manifestaciones neuropsiquiátricas. Revista. Actualidades Dermatológicas. Vol 41 (6). p-511. 
2002.
22. Victoria M Claude. Lupus Band Test. Skin. 2004. Disponible en:http://www.rcpa.edu.au/pathman/lupus-ba.htm. 
23.Ferrandiz Carlos. Discoid Lupus Eruthematosus Diagnostic and Clinical. 2003. Disponible en : http://www.acadermis.com/ 
24. Alahlafi A, Wondworth P, Wojnarowska M. The distribution of IgG subclass switching rather than polyclonal B cell activation. Rev. Clinical and 
Experimental Dermatology. Vol 29 (5). p: 288. 2004.
25. Llanes M. Inmunofluorescence and CDEL (Chronic Discoid Erythematosus Lupus).2004.Disponible en: http://www.atlases.muni.cz/


Hospital General “Lucía Íñiguez Landín”

AUTORES
Luis Yuseff Reyes Leyva(1), 
Eddie Batista Riacardo(2), 
Maria Antonia Escobar Balboa(3), 
Yoanky IbarraTendero(4), 

1. Licenciado en Química. Profesor instructor. Departamento de inmunología. Laboratorio clínico. Hospital General “Lucía Iñiguez Landín”.
2. Licenciado en Biología. Profesor instructor. Departamento de inmunología. Laboratorio clínico. Hospital General “Lucía Iñiguez Landín”.
3. Dra en medicina. Especialista de primer grado en Laboratorio clínico. Profesor asistente. Laboratorio clínico. Hospital General “Lucía Iñiguez Landín”.
4. Licenciado en Biología. Departamento de Genética médica. Hospital General Santi Spiritus. 

Responsable: LuisYuseff Reyes Leyva.
Dirección: Calle 25 No.53 entre Adel Calderón y Manuel Angulo. Rpto 26 de Julio. Holguín.
Teléfono: 42 7911
Email: yuseff@hcqho.sld.cu

Compartir