Monografias | Tinción de Gram

RESUMEN
A causa del tamaño imperceptible de las bacterias por la falta de contraste que hay entre estos organismos usualmente transparentes y el medio que les rodea (fig 1), existe gran dificultad para observarlos con el microscopio óptico, en su estado natural; esto hizo que se crearan métodos para poder apreciar mejor a los microorganísmos, y poder distinguir muchas caracterìsticas estructurales que no son fàciles de apreciar; siendo la utilización de colorantes el medio más simple de aumentar el contraste.

La tinción de Gram es una técnica de coloración de contraste o diferencial, que se desarrolló en 1844 y se utiliza en microbiología para la observación de bacterias, las cuales, con base en la reacción que tengan las paredes de los microorganísmos a los colorantes usados con esta técnica, se les califica en grampositivos y gramnegativos; considerándose bacterias Gram positivas a las bacterias que se aprecian en color violeta y en color rosa bacterias a las Gram negativas, otra ventaja es que se puede efectuar una percepción primordial a las diferencias entre bacterias, por su morfología (Cocos Bacilos y Espirilos).


Fig 1 Microfotografìa a)Agua de charco donde se observan algunos microsorganismos (40x) y en b) se pueden observar Euglenas (100x) 

Debido a que la tinción bacteriana es un trabajo de rutina, es común que este se realice siguiendo una receta, la cual puede encontrarse en un libro o en alguna página WEB, etc.; sin embargo cuando alguien pregunta que ocurre a nivel celular durante el proceso de tinción, pocas veces queda claro este suceso sea por que el conocimiento fue borrado por la rutina o por ignorancia; justo se escogió a la tinción de Gram por ser una técnica muy usual para cualquier estudio microbiológico que se desarrolle; siendo entonces el objetivo de este trabajo el que el lector aclare este proceso y pueda en algún momento no solo comprenderlo sobre esta técnica; si no aplicar lo sobre otras técnicas de tinción e incluso adquirir o recordar conocimientos sobre características celulares poco apreciadas que sin embargo pueden influir no solo para distinguirlas en el microscopio; si no para considerar estas características para otro tipo de efectos como sería el ataque de virus. 

INTRODUCCIÓN
El imperceptible tamaño de las bacterias y otros microorganismos así como la dificultad para observarlas en detalle con el microscopio óptico por causa de la falta de contraste que existe entre estos, debido a que son usualmente transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan métodos para poder apreciarlas, siendo “los métodos más sencillos el de fijación y tinción, iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, los que permitieron a los microbiólogos distinguir muchas características estructurales normalmente vistas” así el uso de colorantes, es el medio más simple de aumentar el contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir entre distintos tipos de células o para apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, mitocondrias, núcleos, membranas celulares, etc.

Existen numerosos colorantes, y en su mayoría son compuestos orgánicos naturales que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Los colorantes que se utilizan usualmente son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los componentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con los elementos celulares cargados positivamente, como son las proteínas (Eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado por sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose generalmente para revelar la localización de los depósitos de grasa (negro de Sudán).

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio de microbiología. Su aplicación práctica es innegable sobre todo en el trabajo microscópico de rutina; las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos fig1) se basan precisamente en la tinción de GRAM*

Fig 2: Imagen de Cocos (forma esférica), bacilos (forma alargada, como bastones) y espirilos (forma espiral)* 

Esta técnica de coloración de contraste fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. Es de considerarse que la reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.

La capacidad de las células para captar la coloración Gram solo es aplicable de manera adecuada en bacterias; como puede advertirse en las células de vegetales y animales superiores, que no conservan uno de los colorantes de los que está compuesta la técnica; los hongos miroscópicos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios tienden a retener el colorante. 

El fundamento de la técnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas (fig 2 ) posee una gruesa capa de peptidoglucano , además de dos clases de ácido teicoico. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el acodo lipòteicoico y en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)


Fig. 3: Estructura de la pared celular en las bacterias Gram positivas

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido fig 3 y lipopolisacárido (que se encuentra en la cara externa de la membrana externa de este tipo de bacterias)


Fig 4: En se puede apreciar la estructura básica de los fosfolípidos y en b como se organizan estos donde se aprecia como las cabezas polares de orientan hacia el medio acuoso . 

La clave es el peptidoglucano o mureína (fig4), ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen de manera distinta debido a estas direrencias constitutivas de su pared.

Fig 5: Estructura química del Ácido Peptidoglucano o mureína

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, es debido a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita

Fig 6: Tinciòn Gram, se aprecia a dos tipos de bacilos Gram positivos en color fuerte y en rosa a los Gram negativos 

Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:
El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn y Stearn (1923) establecen que es una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. Ambos investigadores comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y los básicos en medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microbios contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según estos investigadores, los gérmenes grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los gérmenes gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:
1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
3. Los microbios de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
4. Los microbios de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
5. En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
7. La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microbios gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
8. El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos correspondían a periodseos de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción.

Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo.

Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.

La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de las primeras no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de las bacterias grampositivas, a diferencia de la de las gramnegativas, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.

Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram.

Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.

Las bacterias resistentes a la tinción Gram son Mycobacterias , Micoplasmas, formas L, Protoplasmas y esferoplastos

El primer paso en cualquier tinción debe ser siempre la fijación con calor. Posteriormente el cristal violeta penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).

El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el iodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. La función del alcohol-acetona es la quitar el colorante de las bacterias, así si la bacteria conserva el tinte, es Gram positiva y si el tinte no se mantiene es Gram negativa.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

La safranina no es crucial para la técnica por lo que puede o no utilizarse. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas.

Al término de la tinción, las Gram positivas se verán azúl-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)

.Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo.

Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos.

Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.

El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el colorante primario mejor para teñir por el método de Gram.

USOS
En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
- Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección. 
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. (Los morfotipos de los microorganismos identificados en la tinción de Gram deben corresponder con los aislamientos de bacterias realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como el ambiente de incubación.) 
- Importancia de la calidad de la muestra biológica para el estudio, se valora con esto, el número de células inflamatorias (a mayor número de células inflamatorias más probabilidad de que la flora sea representativa del lugar de la infección) así como de células epiteliales (es mayor la probabilidad de contaminación de flora saprófita que no es representativa del lugar de la infección) 

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varias formas distintas:
- Los cocos de forma esférica. Pueden presentarse aislados después de la división celular (Micrococos), por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
- Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
- También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas, si poseen forma de “coma”, - curvados, entonces se les llama vibriones.

TECNICA DE LA COLORACION GRAM
1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera:
• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta coger un poco de muestra. - Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto un espiral en la parte media la lámina.
• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente pare ser colocado sobre el dorso de la mano.

2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 grados

3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo.

4) Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto más.
• El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias

5) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul.

6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

7) Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.

Resúmen
- Recoger muestra estéril 
- Hacer el extendido en espiral 
- Dejar secar a temperatura ambiente 
- Fijar la muestra al calor (flamenado 3 veces aprox.) 
- Agregar cristal violeta al y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color morado las bacterias Gram positivas. 
- Enjuagar con agua corriente. *
- Agregar lugol y esperar 1 minuto. 
- Enjuagar con agua corriente . 
- Agregar alcohol y acetona por goteo y esperar 15 segundos. 
- Enjuagar con agua. 
- Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram negativas. 
- Enjuagar con agua. 
- Chorro suave ya sea con piseta o directo de la llave
- Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión

REFERENCIAS:
Referencias en WEB
- Tinción de Gram http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram 
- Wikipedia, la ”enciclopedia”l ibre Edición en español de Wikipedia, iniciada en el 2001.http://es.wikipedia.org/wiki/Portada , consultada septiembre 23 2006
- PREADO J., VALERIA. Conceptos microbiológicos de Streptococcus pneumoniae: BASIC MICROBIOLOGICAL ASPECTS. . Rev. chil. infectol.. [online]. 2001, vol.18 supl.1 [citado 03 Octubre 2006], p.6-9. Disponible en la World Wide Web: <http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182001000000002&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0716-1018.
- http://www.geocities.com/moralab/docencia.html BRUNO TESSER btesser@puc.cl
- Raisman J.S y Ana M. González nto) Hipertextos del área de la Biología La pared bacteriana 2005 UNNE (Universidad Nacional del Nordeste Argentina) http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm 
- BACTERIOLOGÍA MÉDICA http://ar.geocities.com/nutricion_isalud/powerpoint/bacteriologia_medica.ppt#266,11,Tamaño Consultado 2 oct 2006
- Técnicas de tinción. Fundamentos http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioTinciones.htm
- A veces uno encuentra lo que no está buscando. Alexander Fleming http://www.nacion.co.cr/ln_ee/ESPECIALES/siglo/siglo7/siglo3.html
- http://www.ciencias.uma.es/publicaciones/encuentros/ENCUENTROS62/metodo.html http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema01.html 
- http://www.rnw.nl/informarn/html/cienciapenicilina990902.html 
- EL PEPTIDOGLICANO http://www.microbiologia.com.ar/general/peptidoglicano.html
- Eubacterias Gram Negativas http://www.microbiologia.com.ar/general/gram-negativos.html
- LA PARED CELULAR BACTERIANA http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/05_Micro.html
- AGENTES ANTIMICROBIANOS Y MICROORGANISMOS http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema20.html
- Envoltura celular gramnegativa
- CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE BACTERIAS http://bilbo.edu.uy/~microbio/morfologia.html
- ENVOLTURAS CELULARES http://www2.cbm.uam.es/memoria/regul/pedroma.htm 
- La medicina en la historia http://www.terra.es/personal/eac00002/anti.htm

BIBLIOGRAFIA
- Garrido Farña Germán Isauro, Miguel Angel Cornejo Cortes y Elsa Salinas Jiménez , 2003 “Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biológicas” UNAM México 95 pp.
- Forbes, B.A., Sahm D. F. Weissfeld A.S. 1993 Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 506 pp
- Schlegel, H. G.. 1997. “Microbiología general” 9. ed. Barcelona : Omega, 654pp

AUTORA:
M. en C. Guadalupe Guedea Fernández 
dalethguedea@hotmail.com

[1] Fotografìas tomadas en los laboratorios de Microscopìa de la FES Iztacala UNAM
[2] Bailey-Scott 1985 Diagnostic Microbiology 
[3] Fotomicrografìas tomadas en 40X, en el laboratório de Microscopia de la FES Iztacala UNAM febrero de 2007
[4] fai.unne.edu.ar/.../micro-ianez/03_micro.htm Curso de Microbiología General de Enrique Iáñez Actualizado el 17 de agosto de 1998 consultado en agosto de 2006
[5] http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Mycobacterial_cell_wall_diagram.png
[6] http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglucano y Schlegel,  1997. “Microbiología general”
[7] http://www.nupedia.com/newsystem/upload_file/830/bilayer_micelle.png
[8] Imàgen tomada en los laboratorios de microscopia de la FES Iztacala

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