Monografias | Aislamiento de cepas Escherichia coli productoras de enzimas Beta- lactamasas de espectro extendido en pacientes hospitalizados en el HDCQ Dr. Salvador Allende en el periodo 2005-2006

RESUMEN
Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) son enzimas producidas por bacilos Gram negativos que confieren resistencia a Ceftazidima, Cefotaxima, Ceftriaxona y Aztreonan, son producidas comúnmente por Klebsiella spp, y Escherichia coli, pero pueden aparecer en otros Gram negativos como Enterobacter, Salmonella, Proteus, etc. Las fallas en su detección generan errores terapéuticos en la práctica clínica.

En el estudio realizado a 105 cepas de E coli aisladas de pacientes hospitalizados en el Hospital Docente Clínico Quirúrgico Dr. Salvador Allende en el periodo 2005-2006 se detecto producción de enzimas betalactamasas de espectro extendido en 36 cepas lo que arrojo un 34,2% de prevalencia de cepas productoras de BLEE.

La mayoría de los aislamientos de E coli BLEE provenían de muestras de exudados purulentos, orinas y secreciones del tracto respiratorio superior. La resistencia a aminoglucósidos estuvo implicada. Proponiéndose como opción terapeutita el imipenen o el meropenen y como opción terapéutica adicional el tratamiento con Ciprofloxacino.

INTRODUCCION
El aumento de la resistencia bacteriana en las instituciones de salud es un hecho evidente que ha sido informado en Cuba y en muchos países del mundo, pero el personal medico no siempre ha tenido una clara comprensión de este fenómeno y del papel modulador que sobre el tiene la aplicación de una correcta política de uso de los antibióticos (Nodarse, 1998).

Desde la década de los años 40 a medida que han evolucionado los antimicrobianos han aparecido los diferentes mecanismos de resistencia, incluso a los más modernos. Hoy a más de cincuenta años, padecemos y con más fuerza: la resistencia bacteriana extendida por todo el mundo.

Bacterias de diversas especies han conseguido, mediante mutaciones en el ADN, generar nuevas enzimas betalactamasas de amplio espectro (BLEE) que son capaces de inactivar nuevos fármacos utilizados en su contra. (Nordman, 1993).

Estudios reconocen que el abuso del empleo de los antibióticos y su mal uso en medicina humana y veterinaria, acuicultura y cultivo de plantas, contribuyen a la emergencia de la resistencia (Har, 1998).

En los hospitales las infecciones nosocomiales son causadas tanto por agentes pertenecientes al grupo de las bacterias Gram positivas como las pertenecientes al grupo de las Gram negativas, siendo las complicaciones más importantes las causadas por agentes del grupo de las bacterias Gram negativas y dentro de este la familia Enterobacteriaceae juega un importante papel. Hay que permanecer muy alerta frente a esta familia pues constantemente emergen cepas resistentes que causan graves problemas, sobre todo con afecciones debidas a infecciones adquiridas dentro de las unidades de salud. La resistencia en estas cepas se debe a la producción de enzimas que modifican o inactivan el antibiótico y frecuentemente es mediada por plásmidos. La adquisición de enzimas betalactamasas plasmidicas es la responsable de la resistencia a determinados antimicrobianos (Llop, 2001).

Escherichia coli puede producir enzimas betalactamasas obedeciendo a un origen cromosómico o extracromosomico (mediada por plásmido). (Linares, 2002). El primer aislamiento de BLEE tuvo lugar en Alemania en 1983 a partir de una cepa de Klebsiella ozaenae.

Dada la importancia del estudio de las betalactamasas de espectro extendido en enterobacterias y en especifico de la presencia de estas en E. coli nos dimos a la tarea de realizar un estudio de detección de E. coli BLEE en pacientes hospitalizados en nuestra institución.

MATERIALES Y METODOS
El universo para la confección de nuestro trabajo estuvo constituido por 150 muestras procedentes de pacientes ingresados que llegaron al laboratorio de microbiología del Hospital Clínico Quirúrgico Docente Dr. “Salvador Allende “(H .D.C.Q.Dr. Salvador Allende) en el periodo 2005 - 2006, en las cuales se aislaron e identificaron 105 cepas de Escherichia coli.

Las muestras empleadas fueron provenientes de exudados purulentos, secreciones bronquiales, hemocultivos, y urocultivos, las que fueron procesadas según normas de microbiología (MINSAP Cuba 1971), hasta aislamiento en especies del microorganismo en estudio.

Se les determino la presencia de la enzima betalactamasa empleando pruebas rápidas directas en colonias, como el método yodométrico (Thornsberry, 1977) y el método acidimetrico (Reeves, 1978) .Posteriormente se realizo Screening por difusión para determinar presuntivamente la producción de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) y por ultimo se aplica el método confirmativo utilizando discos de antimicrobianos y discos combinados con ácido clavulanico (por difusión)

Según el método de Screening por difusión el halo obtenido debe ser: como recomienda el NCCLS en sus normas de la zona de inhibición para detectar BLEE

Una vez detectada una cepa productora de enzima betalactamasa de espectro extendido se le realiza la prueba confirmativa empleando el Método de doble difusión con disco en placa de agar Muller-Hinton (Carter et al, 2000)

Este método consiste en la realización de un antibiograma convencional situando un disco de amoxicilina /ácido clavulanico (20/10 ug) a una distancia aproximada de 30mm de discos con cargas estándar (30ug) de cefotaxima, ceftazidima y el aztreonam. La ampliación del halo de inhibición de estos últimos en las proximidades del disco de amoxicilina/ácido clavulanico indica la presencia de una betalactamasa de espectro ampliado.

Criterios de bacterias productoras de betalactamasa de espectro extendido:
1-Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de 3ra generación (C3G)
2-Sinergia entre C3G y ácido clavulanico. 
3-Bordes de halo de inhibición irregulares.
4-Resistencia asociada especialmente a aminoglucósidos. (Hernández y col, 2006).

RESUTADOS
Los resultados obtenidos en nuestro trabajo durante el periodo comprendido del 2005-2006 en el laboratorio de microbiología del Hospital D.C.Q Dr. Salvador Allende se exponen en tablas.

La tabla 1. Muestra el numero de cepas de Escherichia coli aisladas según la localización de la sepsis. El mayor numero de aislamiento estuvo representado
en las heridas quirúrgicas donde se obtuvo un 40% de E coli. Estas heridas quirúrgicas en su mayoría pertenecían a pacientes que habían sido sometidos a intervenciones de ortopedia de larga duración donde existe una gran manipulación, empleándose numerosa cantidad de instrumental lo cual favorece la presencia de gérmenes patógenos y dentro de ellos la principal representante es E coli. (Bhltacharyya y col, 1993). La segunda localización con mayor número de aislamiento de E coli fue la sepsis urinaria para un 28, 57%, datos que coinciden con muchos autores (Kumamoto y col, 1996) que plantean a E coli como el responsable del 30% de las infecciones del tracto urinario. Las infecciones por E coli localizadas en el tracto respiratorio ocupan un tercer lugar con un 20, 95% de estas. 

Tabla 1. Cepas de Escherichia coli aisladas según localización de la Sepsis.

Periodo 2005-2006

Fuente: Estudios realizados en el Hospital D.C.Q.Dr ¨Salvador Allende¨

La tabla 2, muestra los resultados obtenidos al aplicarle los métodos de detección de betalactamasas empleando los métodos yodométricos y acidimetricos a las 105 cepas de E coli aisladas de las diferentes muestras.

El mayor número de cepas de E coli productoras de enzimas betalactamasas se detecto al aplicar el método yodométrico con 36 cepas positivas para un
34, 2%, mientras que al aplicar el método acidimetrico solo se detectaron 21 cepas que representan un 20%.


Tabla 2. Resultados obtenidos al aplicar la detección de betalactamasas empleando los métodos yodométricos y acidimetricos a las 105 cepas de Escherichia coli aisladas.
Periodo 2005-2006

Fuente: Estudios realizados en el D.C.Q.Dr Salvador Allende

Tabla 3, el mayor número de cepas de E coli con presencia de la enzima betalactamasa procedieron de exudados purulentos de pacientes en su gran mayoría con heridas quirúrgicas infectadas y de estadio prolongado que habían sido sometidos a tratamientos antimicrobianos anteriormente, representando el 33,33%.

En segundo orden aparecen las muestras procedentes de urocultivo con un 30,56%, confirmándose una vez más la presencia de E coli en infecciones urinarias y esta vez con producción de enzima betalactamasa y en tercer lugar le siguen con un 25% las procedentes de secreciones endotraqueales.

Tabla 3. Procedencia de las cepas de Escherichia coli productoras de betalactamasas.
Periodo 2005-2006

Fuente: Estudios realizados en el Hospital D.C.Q.Dr ¨Salvador Allende ¨

Tabla 4, cuando enfrentamos nuestras 36 cepas betalactamasa positiva a las cefalosporinas de tercera generación y al Aztreonam obtuvimos una resistencia que oscilo entre un 97,22% y un 100%. Nuestros resultados coinciden con otros autores (Tenover y col, 1995).

La combinación mas utilizada para detectar microorganismos BLEE en muchos laboratorios es la utilización de los discos de Ceftazidima, Ceftriaxona, Cefotaxima y Aztreonam, los que han informado los resultados para cefalosporinas de espectro extendido y Aztreonan como resistentes, señalando que dichos resultados apuntan a la presencia de cepas de E coli productoras de betalactamasa de espectro extendido (E coli BLEE), (Puerta y col, 2005).

Tabla 4: Resultados del método de Screning por difusión en disco (presuntivo) realizado a las cepas de E coli betalactamasa positivo.
Periodo 2005-2006

Fuente: Estudios realizados en el Hospital D.C.Q.Dr ¨Salvador Allende´

Tabla 5, al enfrentar las 36 cepas de E coli presuntivamente productoras de BLEE al método de doble difusión con disco observamos la presencia del doble halo de difusión en la casi totalidad de las cepas confirmándose la presencia del fenotipo BLEE y por tanto que son E coli BLEE (Tenover y col, 1995).

La mayor producción de enzima BLEE fue frente a aztreonam, Ceftazidima y Cefotaxima respectivamente. Similares resultados al enfrentar estos discos antimicrobianos frente a algunos microorganismos Gram negativos fueron encontrados por otros autores (Larrinaga, 2002). Resultando la Ceftriaxona de menor producción de enzimas BLEE ya que en una de las cepas no se produjo el doble halo.

Tabla 5 Resultado de la aplicación del método confirmativo de doble difusión con disco a las cepas de E coli BLEE.
Periodo 2005-2006

Fuente: Estudios realizados en el Hospital D.C.Q. Dr ¨Salvador Allende¨


La tabla 6, refleja el comportamiento de las E coli BLEE relacionadas con las E coli no productoras de BLEE según su resistencia antimicrobiana.

El resultado de los antibiogramas realizados a E coli BLEE mostró una resistencia casi total a las cefalosporinas de tercera generación (Ceftazidima, Ceftriaxona y Cefotaxima), así como el Aztreonam. La resistencia a los carbapenemicos representados por el Imipenen y el Meropenem fue muy baja, prácticamente nula y la resistencia a la combinación de amoxicillina con un inhibidor de las betalactamasas (ácido clavulanico) fue de un 2,77%.

Tabla 6. Comportamiento de la resistencia antimicrobiana in vitro de E. coli productora de BLEE y E. coli no productora de BLEE, aisladas de pacientes hospitalizados. 
Resistencia antimicrobiana 

Fuente: Estudios realizados en el Hospital D.C.Q.Dr. ¨Salvador Allende¨.

DISCUSION
Las infecciones de los tractos urinarios y respiratorios, de heridas quirúrgicas y del torrente circulatorio representan alrededor del 80% de las infecciones nosocomiales denunciadas (Lennette y col, 1982). 

En investigaciones realizadas en nuestro laboratorio en el año 2003 se encontró que el 85% de las bacterias aisladas en las áreas de atención al grave fueron gran negativas y el mayor por ciento de estas eran E coli (González y col, 2003).

La detección de enzimas betalactamasas por la prueba yodométrica resulto ser mas sensible en nuestros resultados, aunque muchos autores recomiendan el método acidimetrico o el cromogenico como de mayor sensibilidad (García y col, 2000). Estos métodos son de gran utilidad debido a que las enzimas betalactamasas pueden detectarse de forma inmediata y exactamente, con procedimientos químicos simples de detección de dicha enzima y los resultados se conocen mucho más rápido que los de las pruebas comunes de susceptibilidad.

Estudios resientes encontraron 31,2% de cepas de E coli betalactamasas positivas en pacientes hospitalizados (Ramos y col, 2006) lo que avala a favor de los encontrados por nosotros, que representaron un 34,2% de E coli betalactamasas positivas.

. La prevalencia de E coli betalactamasa positiva ha aumentado de forma significativa desde 1999, la mayoría de los aislamientos de betalactamasas positivas en E coli proceden de muestras de orina (40%) y exudados de heridas (30%). Datos que confirman los encontrados en nuestro estudio (Burgués D S, 2004). 

En sentido general el hallazgo de encontrar cepas productoras de betalactamasas estuvo aproximadamente entre un 25% y un 33% lo que nos hace pensar que en todos los tipos de muestra donde estén presentes E coli, es necesario realizar pruebas de detección de betalactamasa, pues estas enzimas presentes en este tipo de germen las hace más resistentes a los tratamientos antimicrobianos por lo que representa un peligro en el aumento de la morbimortalidad.

Las betalactamasas de espectro extendido son enzimas producidas por bacilos Gram negativos que tienen la habilidad de inactivar antimicrobianos betalactamicos con un grupo oximino (cefalosporinas de tercera generación y Aztreonam). Estas enzimas son producidas comúnmente por Klebsiellas spp y E coli (Goussar y col, 1999).

Los por cientos de resistencia que arrojo nuestro estudio están avalado por otros autores que plantean que la Ceftazidime resulta un buen sustrato para muchas BLEE y así, es un agente indicador apropiado para su uso en las pruebas de sensibilidad antibiótica, cuando emplearon Ceftazidima el 94% de los reportes de susceptibilidad fueron catalogados como resistentes o intermedios (Rice, 2001).

En un estudio de 38 laboratorios, demostraron que todas las instituciones que emplearon Ceftazidima (65,8%) reportaron un resultado intermedio o resistente en los microorganismos productores de BLEE. Los laboratorios que incluyeron Ceftazidima en sus pruebas tuvieron mayor probabilidad de detectar microorganismos productores de estas enzimas que aquellos que no la emplearon. Lo cual sugiere que la Ceftazidima podría ser sensible para detectar muchas cepas (Tenover y col, 1995).

Para diferenciar la producción de BLEE de la producción de otro tipo de enzimas que también confieren resistencia a oximino, Cefalosporinas y Aztreonam, es necesario realizar el ensayo confirmatorio con ácido clavulanico ya que se han descrito 3 grupos de bacterias productoras de betalactamasas.

Un primer grupo productoras de betalactamasas denominadas clásicas o de amplio espectro, las cuales van a producir resistencia bacteriana a la amino y carboxipenicilinas, pero con sensibilidad a las cefalosporinas, monobactamicos y carbapenemicos. Un segundo grupo en que las betalactamasas van a ser de espectro extendido (BLEE y en ingles ESBL) es decir, que su acción va a dirigirse contra todas las cefalosporinas incluyendo las de tercera generación y la sensibilidad de estas bacterias es a los inhibidores de betalactamasas y carbapenemicos. Estas bacterias van a presentar resistencia también a los aminoglucósidos, limitan mucho a la eficacia de los betalactamicos y se asocian con una elevada morbimortalidad. El tercer grupo va a estar caracterizado por producir betalactamasas resistentes a los inhibidores de las mismas es decir, al tazobactam, al ácido clavulanico y al sulbactam. Estas bacterias también van a ser resistentes a aminoureido y carboxipenicilina. Son sensibles a las cefalosporinas, carbapenemicos y monobactamicos (Boo, 2004 y Hochtkiss, 2003). al enfrentar las 36 cepas de E coli presuntivamente productoras de BLEE al método de doble difusión con disco obser una ampliación de los halos de inhibición de la cefatoxima, Ceftazidima y el aztreonam en las proximidades del disco de amoxicilina / ácido clavulanico debido a la inhibición de la betalactamasa plasmidica de espectro extendido por la acción del ácido clavulanico contenido en el disco de amoxicilina / ácido clavulanico (Jarlier y col, 1988), lo que indica que la mayor producción de enzima BLEE fue frente a aztreonam, Ceftazidima y Cefotaxima respectivamente. Similares resultados al enfrentar estos discos antimicrobianos frente a algunos microorganismos Gram negativos fueron encontrados por otros autores (Larrinaga, 2002).

Resultando la Ceftriaxona de menor producción de enzimas BLEE ya que en una de las cepas no se produjo el doble halo. Algunos autores plantean que aun siendo una cepa sensible a uno de estos antimicrobianos (Ceftriaxona, Cefotaxima), pero resistente a la Ceftazidima y al aztreonam, se puede decir que estamos en presencia de una cepa productora de enzima BLEE. Entonces podemos afirmar que nuestras 36 cepas de E coli fueron productoras de enzima BLEE. (Navarro y col,

Se desconoce la prevalencia real de las BLEE, probablemente son subestimadas las cifras que habitualmente se comunican. Como destacan en su estudio SENTRY (Winokur y col, 2001), el creciente aumento de las BLEE es un problema mundial de proporciones enormes, en Europa se ha visto un importante incremento desde hace varias décadas, y el fenómeno parece estar lejos de ser controlado (Patherson, 2001).

The National Committe for Clinical Laboratory Standard (NCCLS) recomienda la investigación sistemática de la producción de BLEE en cualquier aislamiento de Klebsiella o E coli (NCCLS, 2003). El Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria (GEIH) de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC), publico en el 2003 los resultados de un estudio efectuado en el año 2000 en cuarenta hospitales españoles (Hdez y col, 2003) y ha sido el primer estudio que ha puesto de manifiesto la relevancia de los bacilos Gram negativos con BLEE. Se identificaron microorganismos con enzima BLEE en el 90% de los hospitales participantes, aislándose cepas de E coli BLEE positivas en el 82,5% y cepas de Klepsiella pneumoneae BLEE en el 42,5% de los centros, lo cual coincide con la presencia de E coli BLEE en nuestros estudios.

Los principales determinantes para la selección y la diseminación de cepas productoras de BLEE parecen ser la duración y el espectro de la antibioticoterapia recibida previamente por los pacientes.

Las cepas productoras de BLEE son multirresistentes. Presentan resistencia a todos los betalactamicos, excepto a cefamicinas y carbapenemicos. Además los plásmidos que codifican esta resistencia portan genes de resistencia a otros antibióticos como aminoglucósidos y tetraciclinas, y el fenómeno de la resistencia cruzada es muy frecuente (Oteo y col, 2002).

Las cepas productoras de BLEE con frecuencia pueden parecer sensibles a los oximino betalactamicos, debido a diferencias cuantitativas en la actividad hidrolitica de determinadas BLEE sobre los sustratos, siendo en realidad resistentes. Esto provoca que en ocasiones el paciente reciba un tratamiento inadecuado. De esta forma algunos estudios han demostrado que las cefalosporinas de amplio espectro no son eficaces en las infecciones producidas por bacilos Gram negativos con BLEE, incluso cuando estas son aparentemente sensibles in vitro (NCCLS, 2003).

La resistencia a antibióticos no betalactamicos es significativamente mas frecuente en cepas de E coli productoras de BLEE que en las no productoras, lo cual fue constatado en nuestro resultado con el incremento de la resistencia de estas bacterias a los aminoglucósidos (amikacina y gentamicina), la resistencia de las betalactamasas plasmidicas es transferible. El que se encuentren codificados en plásmidos conjugativos posibilita la diseminación de este mecanismo de resistencia no solo entre distintas cepas de la misma especie sino también entre diferentes especies bacterianas. Además las BLEE frecuentemente se incluyen en transposones o integrotes, lo cual determina su asociación con otros determinantes genéticos de resistencia transferible, como los que conllevan resistencia a los aminoglucósidos o al cotrimoxasol.

Algunos laboratorios sugieren como opciones terapéuticas al imipenen donde obtuvieron un 100% de sensibilidad y como opción terapéutica adicional ciprofloxacino con un 81%(Puerta y col, 2005) de sensibilidad lo que avala nuestros resultados donde la sensibilidad obtenida para imipenem fue 97.23% y para el ciprofloxacino de un 77.78%.

Los carbapenemicos están indicados como el tratamiento de elección de las infecciones graves por bacterias Gram negativas productoras de BLEE, estos son altamente estables a la hidrólisis por betalactamasas y parecen ser los únicos capaces de mantener la actividad bactericida durante 24 horas frente a altos inóculos de cepas BLEE (Burgen y col, 2004).

El uso de los carbapenemicos en la practica clónica debe ser especialmente juicioso, primero porque constituye casi la única terapia eficaz frente a las BLEE y además porque su uso indiscriminado puede inducir la aparición de cepas de bacilos Gram negativos no fermentadores (Acinetobacter sp, Pseudomonas, etc.) multirresistentes. 

CONCLUSIONES 
1- En nuestro estudio se aislaron 105 cepas de E coli. La mayoría de las cepas procedían de muestras de heridas quirúrgicas (40%), de muestras de orina (28,57%) y de secreciones del tracto respiratorio superior (20, 95%). 
2- El metido yodométrico resulto ser el más eficaz para la detección de enzimas betalactamasas donde se obtuvieron 36 cepas betalactamasas positivas para un 34,2%. Mientras que el método acidimetrico detecto 21 cepas betalactamasas positivas para un 20%.
3- La mayoría de las cepas de E coli betalactamasas positivas precedían de exudados purulentos representando un 33,33% y las muestras de orina 30,56% 
4- De un total de 105 cepas de E coli se confirmaron 36 cepas de E coli BLEE, las cuales fueron aisladas de muestras de pacientes que habían sido sometidos previamente a tratamiento de cefalosporinas de tercera generación.
5- Se detecto que las cepas de E coli que producen una BLEE por lo general son multirresistentes con resistencia compartida a aminoglucósido.
6- El tratamiento a aplicar a los pacientes en que se ha aislado una cepa de E coli BLEE pueden tratarse con carbapenemicos o la combinación de un betalactamico con un inhibidor de betalactamasa.

RECOMENDACIONES
Recomendamos realizar un chequeo periódico al personal de la salud y a los pacientes con largo periodo de estadio que han sido tratados previamente con cefalosporinas de tercera generación donde es factible el aislamiento de cepas BLEE.

Proponemos la instauración de métodos diagnósticos para la detección de cepas BLEE en toda la red de laboratorios de microbiología de nuestro país, por la importancia que esto reviste.

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AUTORA
Lic. Marivel A. Bermudez Garcia

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