Monografias | Administración intranasal de la eritropoyetina humana recombinante como neuroprotectora sobre el daño cerebral isquémico en gerbil de Mongolia

RESUMEN
La rHu-EPO ha mostrado un potente efecto neuroprotector tanto in vitro como in vivo. Por tanto, hacer llegar la rHu-EPO al SNC tan rápido como sea posible es una estrategia para minimizar los daños inducidos por isquemia. Una vía reportada recientemente para hacer llegar la rHu-EPO al SNC es a través de la cavidad nasal. Por tanto el objetivo de nuestro trabajo fue hacer llegar de una forma rápida, con la máxima seguridad la molécula de rHu-EPO con bajo contenido de ácido siálico al SNC y demostrar su eficacia terapéutica en la isquemia cerebral inducida en gerbil de Mongolia. 

Se emplearon 158 gerbils de Mongolian donde se aplicó el procedimiento quirúrgico de la oclusión unilateral permanente de la carótida, se marcó la molécula con I125 para verificar su paso al cerebro, se evaluó el estado neurológico, la actividad motora, la evaluación histopatológica, así como la valoración del edema. Los resultados sugieren que las gotas nasales de rHu-EPOb llegan al cerebro por la vía nasal y ejercen un efecto neuroprotector en un modelo animal de isquemia aguda, que se refleja en una significativa mejoría en la conducta motora, el estado neurológico, la curva de peso corporal, la disminución del edema cerebral y las evidencias histopatológicas en este modelo. La vía nasal constituye una alternativa de acceso de la molécula de rHu-EPOb al encéfalo. Las ulteriores investigaciones permitirán corroborar estos resultados, así como evaluar su utilidad en la profilaxis contra el ictus cerebral.

Palabras claves: Neuroprotección, Eritropoyetina, vía nasal, Mongolian gerbil, isquemia cerebral

Abstract
The neuroprotective actions of the rHu-EPO have been broadly studied in experimental models and there have been carried out clinical trials with satisfactory results. Different ways have been used to make the molecule delivery to the CNS. In this paper, we showed that via nasal application of rHu-EPO diminished the cerebral damage after ischemia in Mongolian gerbils. These results suggest a new therapeutic alternative for the neuroprotection in stroke. Nasal drops of rHu-EPO have a high potential of clinical utility as therapeutic protein to prevent the cellular death in the ischaemia brain. These results constitute the first report that nasal drops of rHu-EPO arrive to the brain and have a neuroprotective effect .The protective effect is demonstrated by a significant improvement in the behavior, motor activity, the neurological condition, the curve of growth, decrease of the cerebral edema and with a higher survival of the cells CA1 of the hipocampo. The nasal way for the treatment of the stroke offers the following advantages: a quick arrival to the lesion place is achieved, which is critical when achieving a therapeutic effect in front of the cerebral hypoxic; it eliminates the risk of inducing eritropoyesis; the way employed assures the arrival of the molecule to poor or not irrigated areas of the central nervous system; the non traumatic way eliminates the surgical risks or other possible implications given by traumatic ways; it constitutes an alternative way of access to the brain without damaging it. It can be employed for the treatment and / or the prevention of the vascular brain illness.

Key words: Neuroprotection, Erythropoietin, nasal way, Mongolian gerbil, ischaemia brain.

INTRODUCCIÓN
Hasta el presente, no existe una droga que sea lo suficientemente efectiva, específica y de seguro acceso al sistema nerviosos central (SNC), para ser usada como neuroprotector en enfermedades neurológicas en etapa crónica o aguda. Además, la mayoría de los agentes o drogas utilizados como neuroprotectores efectivos en biomodelos de isquemia fallan por no ser toleradas clínicamente (15, 20, 47). Una estrategia lógica para encontrar una solución a esta dificultad pudiera ser el uso de las mismas moléculas que el cerebro utiliza ante diferentes injurias (19) con el objetivo de mantener la homeostasis.

La observación de que la eritropoyetina humana recombinante (rHu-EPO) es expresada en el cerebro y es regulada por el factor I inducible por hipoxia (18), activado por una amplia variedad de estresores, ha estimulado el desarrollo de estudios del efecto neuroprotector de la rHu-EPO en diferentes modelos de infarto cerebral (13, 23). En estos estudios, la rHu-EPO ha mostrado un potente efecto neuroprotector tanto in vitro como in vivo (4, 5, 8, 13). Este efecto se manifiesta a través de la potenciación de mecanismos antiapoptóticos, antiinflamatorios, neurotróficos y moduladores de la excitabilidad neuronal (38, 49). La acción de la rHu-EPO se encuentra mediada por los receptores que se encuentran en las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales y los astrocitos (7, 17, 45). 

En la literatura existen numerosas evidencias en modelos in vitro e in vivo del efecto protector de la rHu-EPO ante diferentes daños cerebrales (5, 8, 24, 28, 29, 30, 33, 50). Recientemente, un ensayo clínico usando rHu-EPO como tratamiento agudo en la isquemia cerebral demostró que la rHu-EPO fue bien tolerada y con resultados alentadores (21). Sin embargo, todas las investigaciones realizadas hasta el presente usan las vías endovenosa o intracerebroventricular para hacer llegar la rHu-EPO al sistema nervioso central (SNC). La vía endovenosa requiere de un tiempo relativamente largo para la llegada al cerebro de una cantidad suficiente de rHu-EPO para ejercer un efecto terapéutico significativo, mientras que la vía intracerebroventricular es clínicamente impracticable. El tiempo es un factor crítico para proteger al cerebro isquémico. Por tanto, hacer llegar la rHu-EPO al SNC tan rápido como sea posible es una estrategia para minimizar los daños inducidos por isquemia. Una vía reportada recientemente para hacer llegar la rHu-EPO al SNC es a través de la cavidad nasal (50). Esta vía de administración podría ser mucho más segura y 10 veces más rápida que la vía endovenosa, utilizada para hacer llegar medicamentos al cerebro dañado.

Hasta el presente, en los estudios preclínicos y clínicos donde se ha utilizado la rHu-EPO como neuroprotector, ha sido utilizada fundamentalmente la vía endovenosa para hacer llegar esta molécula al SNC. Esto constituye un riesgo potencial de estimulación de la eritropoyesis, la cual incrementaría la viscosidad de la sangre. Por tanto, para estimular la acción neuroprotectora endógena que realiza el cerebro ante una injuria hipóxica se puede utilizar una molécula de eritropoyetina con bajo contenido de ácido siálico similar a la sintetiza en estas condiciones (24). Esta molécula de rHu-EPO tendrá que llegar al SNC evadiendo su paso por el hígado donde sería degradada. Esta sería una ventaja adicional del uso de la vía nasal. 

Por tanto el objetivo de nuestro trabajo fue hacer llegar de una forma rápida, con la máxima seguridad la molécula de rHu-EPO con bajo contenido de ácido siálico al SNC y demostrar su eficacia terapéutica en la isquemia cerebral inducida en gerbil de Mongolia. 

Materiales y Métodos:
Animales: Se emplearon un total de 158 gerbils de Mongolia provenientes del CENPALAB para los diferentes experimentos. El protocolo de cada ensayo fue discutido y aprobado por el Comité de Etica Institucional para el cuidado y uso de animales de laboratorio, que tiene en cuenta lo establecido en las normas internacionales del ICLAS para estos ensayos.
La molécula de rHu-EPO con bajo contenido de ácido siálico (rHu-EPOb), fue suministrada por el Centro de Inmunología Molecular (CIM, Habana, Cuba). La solución de rHu-EPO fue preparada en solución de 0.15 mM, tamponada a pH 7. 

Marcaje de la (rHu-EPOb) con I125: Para determinar el paso de la rHu-EPOb, cuando se aplican por vía nasal, a regiones del sistema nervioso central, se marcó con yodo125, según el método descrito (6). A partir de este marcaje radiactivo se preparó una formulación con solución salina de 1 mg/ml para su aplicación por vía nasal (vn). Se emplearon 18 gerbil de Mongolia machos de peso corporal entre 70 y 90 g. Todos los animales recibieron entre 100 y 120 μl de la formulación referida por vía nasal. En intervalos de 5, 30 y 60 minutos los animales fueron sacrificados por decapitación bajo anestesia. El encéfalo fue removido en menos de 70 segundos. El bulbo olfatorio y el cerebelo fueron disecados. El conteo radiactivo se realizó en un contador gamma. Pracitronic. RPCH, geometría 4π. 
Eficacia terapéutica: Se emplearon 50 gerbils de Mongolia de ambos sexos, con un peso corporal entre 60 y 70 gramos, con agua y alimentación ad libitum, mantenidos en un ciclo de 12 horas alternas de luz-oscuridad durante todo el período experimental.

Los animales fueron anestesiados por vía intraperitoneal con diazepán (5.0 Mg/Kg.); ketamina (47 Mg/Kg.) y atropina 0,02 mg / Kg.los animales fueron lesionados según el método descrito por Butterfield y McGraw (9). En síntesis se procedió a la exposición de la carótida derecha bajo estereoscopio, que fue doblemente ligada y seccionada. Los animales falsamente lesionados fueron suturados sin ligar ni cortar la carótida. 

Para la evaluación clínica e histopatológica, los grupos experimentales fueron:
Grupo control: falsos lesionados n=10.
Grupo de animales lesionados tratados con solución salina vn: n=20.
Grupo de animales lesionados con administración de la rHu-EPOb, vn: n=20.

El tratamiento consistió en la aplicación en la cavidad nasal de 10 μl de rHu-EPOb o solución salina cada 8 h, desde el intervalo de la primera hora después de la operación hasta el 4to día posterior a la operación. 

A cada animal se le determinó el estado neurológico mediante una escala de 2 a 5 que incluyó el tono corporal, la fuerza prensil y las alteraciones en la postura y la marcha. Un animal sin signos patológicos tiene un valor de 5 en esta escala.

Para la evaluación funcional se utilizó también la actividad exploratoria espontánea. Cada gerbil fue colocado en una caja cilíndrica vertical de 30 cm de diámetro y 25 cm de altura. Los empinamientos en dicha caja fueron contados en un intervalo de 3 minutos.

A los 7 días posteriores a la operación, los animales fueron perfundidos a través del ventrículo izquierdo con formaldehído al 4% en PBS a pH 7.0. Los cerebros fueron extraídos y mantenidos en esta solución algunos días. Posteriormente fueron incluídos en parafina, seccionados a 4 mm y teñidos con hematoxilina y eosina. Las secciones fueron evaluadas a 10x y 40x, sin conocimiento previo de su identidad. 

Para la evaluación del edema cerebral, se utilizaron 90 hembras entre 60 y 70 g comprendidas en 3 grupos experimentales:
Falsos lesionados (n = 20)
Lesionados sin tratamiento (n = 35)
Lesionados con tratamiento (n = 35)

A las 3, 12 y 24 horas de la lesión los animales fueron anestesiados y perfundidos con solución salina. El encéfalo se extrajo de la cavidad craneana y los hemisferios fueron separados. La determinación del contenido de agua se realizó según el método gravimétrico descrito por Danica y col, 2000 (15) según la ecuación: %Agua = [(Peso Húmedo - Peso seco) X 100 X Peso Humedo-1]. Para el análisis de los datos se establecieron diferencias entre grupos y muestreos para cada variable mediante los test t de student, anova (una vía) y el test de Dunnett para la comparación múltiple).
Para evaluar el peso corporal de los animales se utilizaron machos que fueron ubicados en 3 grupos de 10 animales cada uno siguiendo el mismo esquema de tratamiento empleado en los experimentos anteriores. Los animales fueron pesados el día de la operación y 1 vez por semana durante 5 semanas. Para el análisis de los datos se establecieron diferencias entre grupos y muestreos para cada variable mediante los test t de student, anova (una vía).

RESULTADOS
Marcaje de la rHu-EPOb con I125
La aplicación nasal de rHu-EPOb marcada con I125 llega a regiones del cerebro en al menos 5 minutos y su contenido va disminuyendo de forma gradual de la región frontal a la caudal (Fig 1). A los 5 minutos la radioactividad del cerebelo es un 25% del valor de la radioactividad del bulbo olfatorio. A los 30 minutos desde su aplicación estas concentraciones casi se igualan y a los 60 minutos el bulbo olfatorio tiene alrededor de un 30% de la radioactividad del cerebelo. 

Eficacia terapéutica:
Se encontró una mortalidad menor en los animales tratados con rHu-EPOb vn durante los días posteriores a la cirugía en ambos sexos, evidenciado en el análisis de las proporciones (Fig. 2).

A las 24 h de la ligadura unilateral, una parte de los animales mostró afectaciones en el estado neurológico que fueron reveladas mediante el examen descrito y expresadas en el puntaje (Fig. 3). Como puede verse, en los animales lesionados sin tratamiento aparece un daño funcional significativo. La actividad exploratoria-motora aparece deprimida en los animales isquémicos no tratados (Fig.4) mientras que en los tratados con rHu-EPOb, se mantiene similar a la de los controles.

El efecto de la lesión y el tratamiento con rHu-EPOb por vía nasal en el modelo de isquemia cerebral (ULP) sobre el peso corporal de los animales se muestra en la Fig. 5. En el grupo control y lesionado tratado se obtuvieron curvas similares, contrastando con la pérdida de peso de los animales lesionados y tratados con salina. Este grupo no pudo recuperar a las semanas el promedio de peso con el cual se comenzó el experimento.

La aplicación de rHu-EPOb vn protegió contra el incremento en el porcentaje de agua en el hemisferio derecho (Fig. 6 a y b). No se encontraron diferencias en el contenido de agua entre los animales tratados con rHu-EPOb vn y los controles. En el grupo de animales lesionados tratados con salina el contenido de agua en el hemisferio derecho se incrementó a las 24 h de la lesión (p>0.001). 

En el estudio histopatológico la frecuencia de animales con el cerebro intacto resultó menor en los animales sin tratamiento que en los controles (p=0.002) y que en los tratados con rHu-EPOb vn (p=0.03).

En animales isquémicos se observó edema generalizado picnosis en el hemisferio derecho, hemorragias en la fimbria del hipocampo y en la corteza parietal del hemisferio derecho, áreas de edema, cromatina densa y difusa en el hemisferio derecho y neuronas picnóticas en el hipocampo.

Discusión
La atractiva hipótesis de favorecer los mecanismos endógenos de la neuroprotección del SNC frente a determinadas injurias ha sido planteada en trabajos recientes por nuestro grupo (28). La hipótesis con la cual hemos desarrollado este trabajo en su esencia coincide con los planteamientos de Shingo, 2001 (43) y demuestra que la utilización de moléculas con acción protectora como la rHu-EPOb constituye una opción terapéutica potencial para contrarrestar daños agudos en el SNC.

Es conocido que diferentes moléculas llegan al SNC cuando son inhaladas utilizando la vía nasal (2, 14). El neuroepitelio olfatorio es la única área en el cuerpo de los mamíferos en el cual el SNC entra directamente en contacto con el medio ambiente (34). Otras proteínas con actividad trófica o neuroprotectoras ha sido demostrado su paso al cerebro por esta vía (3, 26). Esta vía puede ser utilizada para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico con rHu-EPO ante distintas injurias agudas o crónicas del cerebro (17, 50). La detección de rHu-EPOb marcada con I125 en el cerebro después de su aplicación por vía nasal constituye una fuerte evidencia del paso de la molécula por esta vía. 

La detección de la molécula marcada con I125 en regiones no relacionadas con la vía olfatoria (cerebelo) indica que no sólo está comprometida la vía olfatoria en el paso de moléculas al cerebro. Una posible explicación es la difusión a través del mucus y ulterior permeación a través de discontinuidades que se presentan en regiones del epitelio olfatorio en particular en la zona de la lámina cribiforme, donde la molécula entra en contacto la molécula con el líquido cefalorraquídeo (LCR) y por medio de él podría ser ampliamente diseminada por el SNC (26). Este hallazgo tiene gran importancia práctica, ya que de circular la rHu-EPOb a través del LCR esta podría tener acceso a regiones bloqueadas o parcialmente bloqueadas al flujo sanguíneo lo cual es una evidente ventaja cuando se compara con la vía sanguínea como medio de transporte de la molécula. Otra importancia estratégica de esta vía lo constituye el hecho de que acuerdo a nuestros resultados, la rHu-EPOb llega al SNC en unos pocos minutos después de su administración de por vía nasal. 

Las sustancias transportadas por vía nasal llegan rápidamente al cerebro, según ha sido reportado (3, 42). Además, las cantidades de rHu-EPOb administradas por la vía nasal para alcanzar las concentraciones terapéuticas son significativamente inferiores (50), evitándose excesos innecesarios de la molécula tanto en el SNC como en el periférico. 

En la parte superior de la cavidad nasal se encuentran las terminales nerviosas responsables de conducir la información del olor a través de la placa cribiforme (3, 14). Por los oficios de la placa cribiforme pasan los haces de cordones nerviosos que constituyen el tracto olfativo del SNC, que se extiende desde la base del cerebro a diferentes regiones subcorticales. Ciertamente, hacer llegar la rHu-EPO al cerebro a través de la vía nasal permite evadir la barrera hematoencefálica. 

El modelo de isquemia unilateral en el gerbil ha sido utilizado para el estudio de la fisiopatología de la isquemia cerebral y para la evaluación de agentes neuroprotectores (9, 11, 25, 31, 32, 35, 47). En este modelo de lesión se ha reportado una mortalidad entre el 25 y el 50 % de los animales (39, 40). En nuestros resultados se encontraron evidencias de isquemia en el hemisferio correspondiente a la oclusión de la carótida y una alta mortalidad en hembras y machos de 53 y 42% respectivamente. No obstante, se logró una supervivencia de 66% en hembras (p = 0.03) y de 76% en machos (p = 0,005) tratados con la rHu-EPOb. Al mismo tiempo se observó una mayor integridad funcional a los 7 días en los gerbils tratados con rHu-EPOb vn cuando son comparados con los animales isquémicos no tratados. 

Asimismo, la actividad exploratoria y motora expresada por el número de empinamientos en un recipiente nuevo, se conserva en los animales lesionados y tratados rHu-EPOb vn. Los resultados obtenidos son un aval de la efectividad de rHu-EPOb vn para contrarestar la isquemia en su etapa aguda y potencialmente pudieran aumentar en al menos dos horas la ventana terapeútica para este neuroprotector. Es importante destacar el hecho de que por esta vía la molécula de rHu-EPOb vn fue detectada en el cerebro en solo 5 minutos.

En el modelo de isquemia cerebral utilizado se pudo determinar que la aplicación de rHu-EPO vn produjo una significativa disminución del número de empinamientos cuando se comparó con el grupo de animales lesionados tratados con salina (p<0.05). Esto indica un efecto protector de la rHu-EPOb, que asemeja la respuesta de los animales tratados con rHu-EPOb vn a la de los animales controles. 

El estudio de peso corporal se realizó durante un período relativamente largo (5 semanas) donde quedó demostrado que en condiciones de libre consumo de agua y alimento los animales lesionados y tratados por vía nasal rHu-EPOb tuvieron una curva de peso similar a la de los animales controles. Una posible explicación del comportamiento encontrado en este experimento puede ser debido al menos a dos causas no excluyentes: la primera es la afectación motora en general que se manifestó en los animales lesionados tratados con salina que se observó en la conducta de empinamientos favorable a los tratados con rHu-EPOb vn, lo que podría explicar una relativa disminución en la posibilidad de alimentarse. Otra posible explicación radica en la afectación de áreas cerebrales asociadas al apetito que fueron afectadas por la lesión y protegidas por la rHu-EPOb. Cualquiera que sea el mecanismo que modifica la conducta alimentaria fue capaz de ser protegido por la aplicación de la rHu-EPOb vn nasal.

Otro importante indicador en modelos de isquemia cerebral es el edema (46). Este indicador fue minimizado cuando la rHu-EPOb fue aplicada en los animales lesionados. En los procesos de isquemia es conocido que están presentes tanto el edema vasogénico secundario como el edema citotóxico (10). La evidencia experimental indica que al menos en las primeras 24 horas se pudo controlar el edema en el cerebro de los animales lesionados y tratados con rHu-EPOb. Esto pudiera estar relacionado con los mecanismos de regulación del Ca++ intracelular que se reporta para la rHu-EPO (37). Estos resultados concuerdan con los reportados por otros autores sobre el rol de la rHu-EPO en la disminución del edema cerebral (41). Ha sido reportado también por otros autores un efecto antinflamatorio de la rHu-EPO en diferentes modelos tales como encefalomielitis autoinmune experimental (1) y daño en médula espinal (7, 12). Esta protección esta justificada por la acción anti-apoptotica (48), antioxidante y angiogénica (49) descrita para esta proteína, lo que justifica su potencial neurotrófico y neuroprotector.

El proponer una explicación de los mecanismos a través de los cuales se obtuvieron los efectos protectores a corto y largo plazo sobrepasa el marco de investigación de este trabajo. No obstante podemos especular que la rHu-EPOb pudiera estar actuando a favor de los mecanismos restauradores y la neuroplasticidad en los animales isquémicos. Lo planteado por Shingo y col (2001) (43) de que la rHu-EPO regula la producción de progenitores neuronales a partir de stem cells en el cerebro posterior de mamíferos, abre nuevas posibilidades terapéuticas para estimular la auto regeneración tisular endógena y la supuesta recuperación de áreas del cerebro posterior a través de un método seguro y no invasivo. 

Resultó evidente protección significativa del tejido en los animales isquémicos tratados con rHu-EPO vn. Esto permite especular que la aplicación de la rHu-EPO vn puede estar protegiendo al menos hasta 24 horas después de la lesión, donde se plantea que están presentes los mecanismos de necrosis celular. Si bien se ha reportado recientemente por Siren y cols, 2001(44) que la rHu-EPO ácida produce una inhibición de la muerte neuronal por apoptosis en la isquemia cerebral, empleando la rHu-EPOb vn esta protección también mostró ser efectiva contra los mecanismos de la necrosis celular.

En la década de los años 90 se demostró que la rHu-EPO se producía también en el SNC y que tenía acción neuroprotectora en diferentes biomodelos de isquemia cerebral. Recientes investigaciones han demostrado que ante una injuria del SNC la rHu-EPO es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, la cual, no puede pasa en bajas proporciones en condiciones de normalidad del SNC ejerciendo su acción contra la excitotoxicidad, los radicales libres, la inflamación y la apoptosis (5, 16), lo cual se antepone a los mecanismos que inducen la muerte celular.

Hasta ahora no existen suficientes datos disponibles de los resultados clínicos de la acción de la rHu-EPO en la isquemia cerebral. Los primeros datos clínicos con pacientes con hipoxia cerebral tratados con rHu-EPO indican que mejoran la oxigenación del tejido cerebral (21, 36), además de haberse reportado muy buenos resultados en el tratamiento de la esquizofrenia (22). El conocimiento existente hasta el presente de la rHu-EPO constituye un excelente aval para su utilización como neuroprotector contra la isquemia cerebral.

Conclusiones
Estos resultados sugieren que las gotas nasales de rHu-EPOb llegan al cerebro por la vía nasal y ejercen un efecto neuroprotector en un modelo animal de isquemia aguda, que se refleja en una significativa mejoría en la conducta motora, el estado neurológico, la curva de peso corporal, la disminución del edema cerebral y las evidencias histopatológicas en este modelo. La vía nasal constituye una alternativa de acceso de la molécula de rHu-EPOb al encéfalo. Las ulteriores investigaciones permitirán corroborar estos resultados, así como evaluar su utilidad en la profilaxis contra el ictus cerebral.

Graphs:

Fig.1. Radioactivity associated to the molecule of I125 rHu-EPOb in the olfactory bulb and cerebellum at 5, 30 and 60 minutes after nasal application.


Fig. 2. Mortality of both genders in Mongolian gerbils with permanent ligation in the right common carotid artery. Differences were established with the analysis of proportions.


Fig. 3. Effect of the treatment with Hu-EPOb vn on the neurological score of the animals, 24 h after permanent unilateral common carotid occlusion . 


Fig. 4. Effect of the application of rHu-EPOb vn on the rearing counts of Mongolian gerbils 24 h after right common carotid artery occlusion. 


Fig. 5. Effect of the treatment with rHu-EPOb vn on the body weight in the acute and chronic period. In the y axis, percent of the weight before surgery. Solid squares, control; open circles, saline; solid circles, EPO.




Fig. 6. percentage of water in both hemispheres after the oclusion of the right common carotid artery a) with rHu-EPOb b) with saline. 

Fig.7 Histologic score considering pyknosis, edema and necrosis, 24 after the common carotid occlusion in Mongolian gerbils. 

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AUTORES:
Sosa Testé Iliana(1), 
Mengana Tamos Yuneidys(1), 
García Rodríguez J. C.(1), 
García Salman J.D.(2), 
Santana J.(3), 
Subirós Nelvis(2 ) , 
González Triana Consuelo(1 )
Rodríguez Cruz Yamila(4)

1- Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB)
2- Instituto de Neurología y Neurocirugía
3- Instituto Superior de Tecnología y Ciencias Aplicadas. Habana, Cuba
4- Instituto Superior de Ciencias Clínicas y Preclínicas “Victoria de Girón”. Habana, Cuba

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