Monografias | Cinética del crecimientoCinética del crecimientoResumen: Crecimiento microbiano. Medición del crecimiento microbiano. Crecimiento en cultivo intermitente. Factores que afectan la rapidez de crecimiento. Consumo de nutrientes y formación de producto. Rendimiento de biomasa y de producto. Cultivo contínuo. Aplicaciones del cultivo continuo.(V) Índice:
La cinética de crecimiento microbiano constituye
una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la
biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de
crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los mismos, sus formas de
aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos, y sobre todo
el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento
trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes
mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la
utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis
de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
“El
crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales, puede
mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.
a)
Células individuales o
población de células en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de
vida celular. Procesos en laboratorio.
b)
División estocástica de la
población, o división al azar.
La
división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula,
duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática (salva
los organismos cenóticos). De ésta manera una célula da nacimiento a dos células
hijas de tamaño idéntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y
potencialidades.
En el caso de las levaduras, y otros
microorganismos, se presenta una variante que es ka gemación o botón. Se forma
una pequeña protuberancia que aumenta progresivamente de tamaño, luego se
produce la división en el núcleo y migra hacia el botón. Finalmente crece
hasta un tamaño suficiente y posteriormente se separa formando otra célula idéntica
a la madre. Las células hijas, sin importar el procedimiento de división
celular, deben heredar todo el potencial genético y son idénticas.” (1)
10.2.
MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:
El cálculo
del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo
mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular
(peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular
(grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población).
Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos
indirectos.
Métodos directos:
¨
Recuento
del número de células en una cámara Thoma
¨
Peso
seco celular
¨
Determinación
de nitrógeno o de proteínas totales
¨
Determinación
de DNA
Métodos indirectos:
¨
Recuento
de colonias en placa
¨
Recuento
sobre filtro de membrana
¨
Consumo
de oxígeno
¨
Liberación
de dióxido de carbono
¨
Concentración
de un enzima constitutivo
¨
Decoloración
de un colorante
¨
Incorporación
de precursores radiactivos
¨
Medida
de la turbidez
10.2.1. PESO SECO CELULAR:
El peso seco (contenido de sólidos) de las células
bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para
grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los
miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de
este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede
recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.
“El aumento de volumen con la humedad tiene un límite.
Este va creciendo hasta que la célula alcanza un porcentaje de humedad que
corresponde al punto de saturación de la pared celular, aproximadamente del 30
% para todas las especies en cálculos técnicos. A partir de éste valor el
volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el volumen de las células
no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor del 30 % es
un valor para utilizarlo prácticamente, si bien cada especie tiene su punto de
saturación de la pared celular” (2). No sucede así con el peso, cuyo valor
sigue aumentando hasta alcanzar el contenido máximo de agua para la especie
correspondiente. Como consecuencia de lo anteriormente expuesto, se definen,
para una célula los siguientes pesos específicos:
PESO ESPECÍFICO
ANHIDRO:
ρ0
= Peso
anhidro
(Ec. 10.2.1.1)
Volumen Anhidro
PESO ESPECÍFICO
A H% DE HUMEDAD:
ρk
= Peso
al H% de humedad
(Ec. 10.2.1.2)
Volumen al H% de humedad
Cuando la humedad es del 12 %,se llama peso específico normal.
Rs = Peso
anhidro
(Ec. 10.2.1.3)
Volumen a H%
Cuando la humedad H
es superior al punto de saturación de la pared celular.
PESO SECO
VOLUMÉTRICO HÚMEDO:
Rk = Peso
anhidro
(Ec. 10.2.1.4)
Volumen
a H%
Siendo, en este caso, la H inferior al punto de saturación de la pared celular.
El volumen ocupado por los huecos se determina por
desplazamiento de fluidos, por lo que estos no deben reaccionar con la pared
celular para obtener un valor exacto del mismo. Se suelen emplear el agua o el
helio, siendo este naturalmente más exacto al ser el helio un gas inerte.
El agua, como veremos, es sorbida molecularmente
por la pared celular, produciendo una compresión de la misma que enmascara el
valor obtenido, cuyo efecto estudiaremos con la hinchazón. Con respecto al peso
específico real de la célula, o más exactamente peso específico de la pared celular, después de numerosos estudios, se
ha encontrado que, con pequeñas variaciones, se puede considerar para todas las
células prácticamente igual a 1,56.
10.2.2. ABSORCIÓN:
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una
partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada,
parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz
dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz
dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución.
Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir
tres tipos de dispersión.
Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas
más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son
muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos.
Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetría: La turbidimetría mide la
reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y
cuantifica la luz residual transmitida.
Estudios teóricos y experimentales han mostrado
que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del
tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración
de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular
del microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy
diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los
tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para
estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos
viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de
calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es
posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de
microorganismos totales o con UFC.
Absorbancia = K x Peso Seco
(Ec. 10.2.2.1)
K: constante que varía con la
longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la
absorbancia(1/W0).
Peso seco: Concentración celular
bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).
La relación directa entre la absorbancia y el peso
seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones
no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen
desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar
suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor
sensibilidad por el bajo nivel de absorción.
En estos gráficos se puede apreciar que
suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco
tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de
microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.
10.2.3. PESO
HÚMEDO:
Se obtiene a partir de una muestra en suspensión
que es pesada luego de la separación de las células por filtración o
centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La
principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas
muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el
5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular.
Para corregir el peso húmedo se determina la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una
centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos
(como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden
atravesar las paredes bacterianas.
10.2.4 VOLUMEN
DE CÉLULAS EMPACADAS Y NÚMERO DE CÉLULAS:
El crecimiento de una población bacteriana puede
ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede
llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células
individuales, esto es iniciar y completar una división celular.
De esta forma, se considera a los microorganismos
como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número
total de partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número
total de microorganismos en una muestra:
¨
Recuento microscópico de partículas
¨
Recuento electrónico de partículas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de
los microorganismos capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en
cuenta el número de microorganismos viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
¨
Recuento de colonias
¨
Método del número más
probable
Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos
moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos,
la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la síntesis de
los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la
división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el
crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema
enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.
10.2.5.1. RECUENTOS
DIRECTOS:
RECUENTO
MICROSCÓPICO:
Es una
técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente
disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir
de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es
obtener reproductibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra
dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio,
incluyendo pipetas.
Esta
adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al
realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica
o medios mínimos sin fuente de carbono).
Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser.
La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión,
aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.
Una de las mayores ventajas del recuento microscópico
es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los
objetos contados.
Fig.
10.2.5.1-1 Cámara de recuento de Petroff-Hausser Tabla
10.2.5.1-1 Recuento de Microorganismos
Tipo
de cuadro
Area Volumen Factor Cuadrado
total
1.00 x 10-2
2.00 x 10-5
5.00 x 104
Cuadrado
grande
4.00 x 10-4
8.00 x 10-7
1.25 x 106
Cuadrado
pequeño
2.50 x 10-5
5.00 x 10-8
2.00 x 107
(Ec.
10.2.5.1)
1/Dilución: Inversa de la dilución
utilizada para llenar la cámara de recuento.
Número de
cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara
que se utilizaron para contar un el número de bacterias.
Volumen del
cuadrado: Volumen de cada cuadrado de
la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por
ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm
x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)
RECUENTO
ELECTRONICO:
Los contadores electrónicos permiten realizar
recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de
hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan básicamente
de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño conducto.
En ambos compartimientos hay electrodos que miden
la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy
pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada
compartimiento es independiente.
El principio de funcionamiento de estos
instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una
suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través
del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un
microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se
incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del
medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y
contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes.
Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en
la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la
turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden
medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas
de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve
período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es común la
obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.
10.2.6. MASA
DE UN COMPONENTE CELULAR:
“Debido a que la célula no es tan
"lista" (no sabe contar hacia atrás en el tiempo) ni tiene el don de
la predicción (los humanos tampoco, para la mayor parte de las cosas
importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia adelante", ya que
el tiempo de inicio de una ronda de replicación no guarda una relación
sencilla con la división celular previa.” (3)
Entonces,
¿cómo se acoplan división celular y replicación cromosómica? Una clave
hacia la respuesta a esta pregunta es que la razón (proporción) entre orígenes
de replicación y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la
replicación) es igual para todas las tasas de crecimiento. He aquí un modelo
hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos eventos del ciclo
celular:
El sistema de coordinación detecta la concentración
de orígenes de replicación; conforme la bacteria crece, esta concentración va
descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico que desencadena una
nueva onda de replicación. Ello hace que se doble el número de orígenes. Una
ulterior ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo
descender la concentración de orígenes.
Se trataría, pues, de una especie de reloj biológico
y "oscilador" que usaría como medida del tiempo el parámetro de masa
celular, volumen, u otro equivalente, de tal modo que la concentración crítica
de un factor iniciador o la dilución de un represor servirían para disparar la
replicación a una concentración determinada.
Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos que
cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación
(g), mayor es el tamaño medio de las células:
Ø
la
primera división ocurre C+D (60 minutos) después; es decir, con un tiempo idéntico
al que tenía en el medio anterior;
Ø
pero
como en este medio g = 35min, la iniciación de una nueva ronda de replicación
ocurre antes de dicha replicación celular (es decir, C y D se superponen);
Ø
se
observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un tamaño celular mayor que en
el medio pobre, y una masa de inicio (tras la división celular) mayor, alterándose
igualmente el tiempo de inicio.
10.2.7. MEDICIONES
FÍSICAS:
Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo
diferentes parámetros físicos, algunos de los cuales se presentan a continuación.
No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parámetros
del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno
de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto.
En este apartado revisaremos los principales métodos
de recuento de microorganismos. Los métodos para el seguimiento de la evolución
de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos
directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas
de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de
contadores de partículas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún
parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución
del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del
cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso.
Entre los métodos principales de recuento de
microorganismos podemos destacar:
El sistema es fácil de
utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos
filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie
(extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en
profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes
que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento de
microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las
placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística,
es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de
la medida.
Los sistemas de medida del crecimiento celular se
han adaptado técnicamente para poder ser utilizados como sistemas on-line. En
una operación on-line no es necesario extraer la muestra del cultivo para
realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran
volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos
de contaminación.
Antes de cerrar este apartado hay que señalar que
en la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que podemos
detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en
el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al 1% de
los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se
cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros
microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofía
(inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos
microorganismos.
10.3.
CRECIMIENTO EN CULTIVO INTERMITENTE:
10.3.1. CINÉTICA
DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO INTERMITENTE:
En este apartado vamos a revisar el estudio de la
cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado
en un volumen finito. a esto se le denomina
cultivo batch y podríamos
traducirlo por cultivo discontinuo
por contraposición con el cultivo continuo que desarrollaremos más adelante.
El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la
siguiente figura:
Fig.
10.3.1-1 Desarrollo de un Cultivo Intermitente
Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:
(1)
La fase
logarítmica, en la que el microorganismo se adapta a las nuevas
condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer
activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto
más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el
microorganismo.
(2)
La
fase exponencial.
(3)
La
fase estacionaria, en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no
significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos
se compensa por la muerte de otros.
(4)
La
fase de muerte, en la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma
exponencial con una constante k que depende de diferentes
circunstancias.
En la fase de muerte decimos que el número de
microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero ¿qué es un
microorganismo vivo en términos microbiológicos?. Consideramos vivo al
microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido
irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este
concepto porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen por
qué estar metabólicamente inactivos.
10.4.
FACTORES QUE AFECTAN LA RAPIDEZ DE CRECIMIENTO:
10.4.1. EFECTO
DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO:
Si [Et] representa la concentración total del microorganismo en
una reacción y [ES] es la concentración del complejo microorganismo-sustrato,
entonces [Et] - [ES] representa la concentración de microorganismo
libre para reaccionar con el sustrato.
Durante una reacción el microorganismo se unirá al sustrato, hasta que
todas las moléculas se saturen. Usualmente la concentración de sustrato [S] es
mayor que [ES], por lo que no resulta un factor limitante. La razón de formación
de [ES] está definida por
[ES] Rate = k1 ([Et] – [ES]) [S]
(Ec. 10.4.1.1)
Mientras que la disociación está definida por
[ES] disociación
rate = k –1 [ES] – k2 [ES]
(Ec. 10.4.1.2)
Mientras haya microorganismo disponible, la razón de k1 irá
aumentando hasta que se saturen. Si las constantes de reacción y disociación
son iguales, la formación del complejo [ES] se mantiene estable al igual que la
velocidad de reacción. O sea que la generación del producto se mantiene
constante mientras la concentración del sustrato no sea limitante. Esto se
definiría como
[ES] =
[Et] [S]
(Ec. 10.4.1.3)
[S]
+ (k2 + k -1) / k1
La velocidad inicial de la reacción está determinada por
v =
k2 [ES]
(Ec. 10.4.1.4)
Si definimos KM como (k2 + k -1) / k1 y
Vmax como k2 [Et], obtenemos que
v = Vmax [S] / KM
+ [S]
(Ec. 10.4.1.5)
Esta es la ecuación de Michaelis-Menten.
En un estudio de cinética microbiana se mide la actividad en términos de
producto formado por minuto, a distintas concentraciones de sustrato. Si la
actividad es graficada en términos de la concentración inicial del sustrato
versus el producto generado en un lapso de tiempo (velocidad de reacción), la
curva generada es una hipérbole rectangular.
La ecuación que describe todos los puntos en esa línea viene dada por v.
Esta ecuación expresa la velocidad para la reacción de un solo sustrato y se
conoce como la ecuación de Michaelis-Menten:
v
v = actividad microbiana
V max/2
[S] = concentración de
sustrato
KM
Vmax = actividad a [S] infinito
KM = el valor de [S] que da actividad
[S]
igual a ½ Vmax
Fig. 10.4.1-1
Estos últimos dos parámetros son importantes, porque nos dan información
directa sobre cuán bien el microorganismo se une al sustrato (KM) y
sobre cuán bien el microorganismo convierte el sustrato en producto una vez se
une (Vmax). De hecho, KM es la constante de disociación
dinámica del microorganismo con el sustrato, y Vmax es la
concentración molar del microorganismo por la constante catalítica (Kcat).nas celulares 10.4.2. EFECTO
DE LA TEMPERATURA:
Todos los microorganismos tienen una temperatura óptima
de crecimiento. Esto significa que a determinada temperatura la velocidad de
duplicación (o la velocidad de crecimiento poblacional) de los microorganismos
es mayor. Hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el
mismo rango de temperaturas:
Clasificación
Rango
Optima
Termófilos
25 - 80 °C
50 - 60 °C
Mesófilos
10 - 45 °C
20 - 40 °C
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||
