Monografias | Cultivo in vitro en especies del género Pinus

La historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales seremonta a unos 200 años, con la "Teoría de la Totipotencia"formulada por Schwann y Schleiden (1838). A partir de esta teoría nació elcultivo de tejidos y células vegetales.

Un siglo después, Nobécourt, Gautheret y white (1939)consiguieron el primer cultivo de tejidos vegetales auténtico in vitro. Apartir de ése entonces y con los descubrimientos de las fitohormonas auxina ycitoquinina (1955), el desarrollo en este campo ha sido meteórico.

El cultivo in vitro de define como "El cultivo sobre unmedio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos,explanto, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores" (Pierick,1990).

La técnicas de cultivo in vitro, se caracterizan por ocurrira micro escala, en condiciones ambientales optimizadas, en un ambiente estérily generalmente no responden al patrón normal de desarrollo de una planta,pudiendo un tejido aislado originar un callo o embriogénesis somática, porejemplo.

Hoy en día, en nuestro país, la propagación in vitro,embriogénesis somática y organogénesis son las principales técnicas depropagación vegetativa para árboles de interés forestal. Se han logradoimportantes avances, como por ejemplo la micropropagación de especiesrecalcitrantes a estas metodologías.

Estas técnicas comenzaron en los años 40 y representan unaútil herramienta porque permite:

 

• Manipular genotipos en un periodo más corto de tiempo.

   

   

• Requerir de pequeñas cantidades de material de partida

   

   

• Superar las dificultades que presenta la propagación vegetativa en algunas especies.

   

   

• Obtener plantas libres de enfermedades

   

   

• No estar condicionados por las estaciones del año

   

   

• Obtener un alto número de individuos en un corto período de tiempo.

   

 

• Conservación de germoplasma

   

   

• Cultivo de embriones inmaduros

   

   

• Obtención de haploides

   

   

• Embriogénesis somática

   

   

• Mejoramiento genético de especies

   

   

• Recuperación de clones no viables

   

En el caso de las coníferas, sobre todo en especies del géneroPinus, es difícil la regeneración de plantas viables a partir de losprotoplastos por lo que la organogénesis es la forma principal de regenerarPinaceas in vitro.

El cultivo de especies forestales in vitro, ha dado un mayorimpulso y eficiencia a algunas estrategias ya utilizadas en campo, ahorrandotiempo y dinero.

La posibilidad de propagar asexualmente y cultivar individuosseleccionados, incrementaría el rendimiento productivo de las empresas.

Debido a la importancia e influencia del sector forestal enla economía del país y sobre todo de la especie Pinus radiata D. Don, lasprincipales Universidades, Instituciones de desarrollo científico y Empresasforestales, han conseguido notables avances de la investigación biotecnológicaaplicada al campo forestal con ésta especie:

- Universidad de Concepción

En el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad deCiencias Forestales se han obtenidos importantes avances en ésta especie como:

 

• Cultivo in vitro, aclimatación ex vitro y establecimiento de plantaciones forestales con clones selectos de Pinus radiata D. Don. Proyecto de Transferencia Tecnológica, Financiado por Forestal Bio Bio S.A.

   

   

• Embriogénesis somática de Pinus radiata D. Don.

   

   

• Universidad de Chile

   

Ha trabajado con Pino insigne (1979-1983) en el ámbito de unproyecto PNUD/FAO, que fue detenido por falta de presupuesto. En dicho contexto,se trabajó con cultivo de embriones extirpados, obteniéndose plantas enteras(brotes adventicios posteriormente enraizados) y con fascículos, lográndosebrotes adventicios.

 

• Pontificia Universidad Católica de Chile

   

Con ésta especie se realizó un proyecto de investigaciónen conjunto con la empresa BIOFOREST. La propagación in vitro es unaalternativa que posibilita acercarse a una opción clonal en el establecimientode las plantaciones, exhibiendo ventajas tanto en adaptación a condiciones desitios como en el desarrollo de productos específicos.

En el laboratorio de la empresas mencionada han sidoensayadas yemas terminales adultas en medios nutritivos con diversasconcentraciones hormonales, iniciándose formación de brotes en un período de30 días. Trabajando con embriones de cruzamientos específicos, se ha logradoinducir 30 brotes adventicios por embrión y en sucesivos subcultivos, variandolas concentraciones hormonales, se han obtenido plantas in vitro e in vivo encondiciones de invernadero.

 

• Forestal Mininco S.A.

   

Reproducción vegetativa de árboles fisiológicamente jóvenesde Pinus radiata D. Don

Consiste en la propagación rápida in vitro de manera asépticade semillas, embriones, órganos, explanto, tejidos, células y protoplastos deplantas superiores, en un medio nutritivo artificial (Murashige and Skoog).Luego mediante la adición de reguladores de crecimiento al medio de cultivo, seestimula la multiplicación y obtención de plantas completas debido a laTotipotencia inherente en las células vegetales. Mediante esta metodología sepueden obtener altas tasas de multiplicación, a partir de un explante inicialpor ejemplo, en un lapso de un año, varios centenares de plantas, que sonfuente de "semillas" mas sana, libre de enfermedades, en comparacióncon aquella obtenido por medio de propagación convencional. Es posible también,aunque no es en todos los casos, la obtención de plantas libre de virus.

Micropropagar, es el proceso de multiplicar plantas in vitroa partir de un fragmento de una planta madre y del cual se obtiene unadescendencia uniforme en condiciones de asepsia.

Este proceso incluye seis fases:

 

• Fase 0 : Preparación de la planta madre.

   

   

• Fase I : Establecimiento de embriones maduros.

   

   

• Fase II : Proliferación de los brotes.

   

   

• Fase III: Elongación.

   

   

• Fase IV: Enraizamiento.

   

   

• Fase V : Aclimatación.

   

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia,se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrolloadecuado.

Para obtener estos explantos es recomendable mantener a lasplantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas ovarios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta encondiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodoy de la radiación recibida.

Una vez escogida la planta madre, se extraerán losfragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos.

Durante esta fase se espera que los explantos quesobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia)con varios entrenudos.

Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar enun nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otrosrecipientes adecuados.

Luego de la proliferación de los microtallos, se activan lospuntos de crecimiento y se estimula la división celular, mediante citoquininas.

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

 

• Enraizamiento in vitro

   

 

• Enraizamiento ex vitro

   

Los microtallos recién enraizados, son muy sensibles a loscambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el procesodependen de la aclimatación.

Tanto si los microtallos fueron enraizados in vitro como exvitro, en el momento en que se extraen de los recipientes de enraizamiento estánpoco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos han enraizado y crecidoen ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomasperezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentospara evitar la desecación del microtallos. Por otra parte crecer en ambientestan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula biendesarrollada.

Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones dehumedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa eincrementando progresivamente la intensidad de luz.

Embriones somáticos o asexuales pueden resultar de unproceso de diferenciación directa o indirecta a partir de células, órganos oestados callosos intermedios de una planta. Muchas veces los embriones somáticosproliferan y producen embriones secundarios a partir de meristemos somáticos,como las yemas axilares, partes de las flores o de semillas. Estos embrionesadquieren una morfología y comportamiento similar a los embriones naturales deorigen sexual de las plantas. Los embriones obtenidos de esta manera puedenutilizarse para producir semillas artificiales por medio del encapsulado contestas artificiales. Esta técnica es muy prometedora, ya que potencialmente seincrementaría de manera significativa la disponibilidad de propágulos deplantas valiosas de cultivo, se acortaría el ciclo de crecimiento y sedesarrollarían nuevos métodos de conservación y almacenamiento degermoplasma.

La técnica para producir embriones somáticos se inicia conla producción de un tejido calloso que, mediante el uso de combinacionesespeciales de sustancias químicas, da origen a un protoplasto en el que handesaparecido las paredes de la célula, asemejándose a un saco embrionariofloral. Al colocar los protoplastos en el medio adecuado de cultivo comienzan adesarrollarse los embriones somáticos a partir del protoplasto.

Los embriones somáticos pueden incluso encapsularse entestas artificiales para originar semillas sintéticas que se cultiven en elsuelo o utilizarse para la conservación de germoplasma vivo por mucho tiempo,utilizando técnicas de deshidratación y vitrificación, y conservación ennitrógeno líquido. Esto es posible incluso en plantas que originalmenteproducen semillas recalcitrantes.

La formulación de los medios de cultivo es variada, sinembargo, éstos contienen fundamentalmente sales minerales de los macroelementosy oligoelementos como: calcio, potasio, magnesio, nitrógeno, fósforo, azufre,manganeso, hierro, cloro, sodio, zinc, boro, molibdeno y cobre, los cuales sonindispensables para el crecimiento de las plantas. Además, algunos mediosincorporan compuestos orgánicos sencillos como fuentes de carbono (generalmentecarbohidratos), reguladores hormonales del crecimiento (auxinas, citoquininas ygiberelinas), otros reguladores del crecimiento (aminoácidos y vitaminas) y aveces antioxidantes (ácido ascórbico).

Por lo tanto por embriogénesis somática se entiende como elconjunto de etapas que resultan en la formación de un embrión a partir de unexplanto inicial de cultivo resultando en un tejido organizado con estructura.La Embriogénesis Somática se ha aplicado en especies herbáceas, pero se halogrado desarrollar también en plantas leñosas, tanto coníferas comolatifoliadas, significando la propagación clonal a largo plazo con la mantenciónde su fidelidad genética.

La embriogénesis somática ofrece una serie de mejorasrespecto a la micropropagación por vía de la proliferación de la yema axilar,con respecto a las especies de árboles. El beneficio más significativo de laembriogénesis somática es que resulta en unidades que contienen tanto unmeristema de raíz como de brote. Otra ventaja es el potencial de producirgrandes números de propágulos regenerados, el potencial para la inducción delreposo vegetativo y del almacenamiento a largo plazo y la posibilidad deencapsulación en cápsulas o "bolitas" del alginato de sodio.

Medio de cultivo: Según su concentración semisólida demacronutrientes estimula o no la inducción y desarrollo del embrioide en lasfases de iniciación y mantención.

Especie y origen del explanto: Determinante es la fuentedel explanto y su estado de desarrollo en el éxito de cualquier etapa de laembriogénesis, según lo expresado por Márgara (1988)

Elemento gelificante: Se encuentran efectos variados enlos distintos cultivos.

Fitoreguladores: Se encuentra experimentado que en herbáceasy se afirma que una dosis alta de auxina se requiere en la etapa de inducciónembriogénica del callo para después su maduración en un medio privado de lamisma (Pierik, 1988)

Estado de desarrollo del explanto: La principal fuente deexplanto utilizada corresponde a embriones inmaduros en un estado inicial dedesarrollo con la mayor parte de sus estructuras tisulares aun en formación. Unproblema frecuente es la vía de introducción de material es identificar elperiodo exacto post-fecundación en que el embrión se encuentra en un estadomenos desarrollado. Esto se complica cuando los períodos de fecundacióntranscurren meses o años después de la polinización, por lo tanto se requiereespecial cuidado en el análisis del ciclo de fecundación de la especie encuestión.

Aunque en la literatura existan protocolos para la producciónde embriones somáticos de embriones inmaduros sexualmente, hemos observado queeste tipo de explante es inapropiado para una situación comercial, losembriones inmaduros están disponibles sólo en determinados períodos del añoy son difíciles de quitar de la semilla. Además es importante ser capaces deseleccionar material de los individuos maduros cuya respuesta a los factoresambientales es conocida y donde los rasgos de calidad gobernados por los efectosgenotípicos y ambientales han sido identificados.

Actualmente se evalúa la embriogénesis en función del éxitoen las etapas de iniciación de cultivos embriogénicos, producción deembrioides completos y establecimiento de plantas somáticas en terreno. Uno delos países lideres en esta práctica es Nueva Zelanda, que ha producido plantassomáticas desde 1991 usando como fuentes de explantos embriones inmaduros omegagametofitos intactos, utilizando como especie modelo Pinus radiata.

En Chile al cultivo del Pino radiata es dañado por polilladel brote y se quiere controlar mediante el uso de técnicas biotecnológicasdisponibles. Se ha logrado mediante bioensayos demostrar la posibilidad decontrolar el desarrollo de las larvas del insecto en brotes de plantas transgénicascon un gen Bt previamente seleccionado, aplicando embriogénesis somática y deTransformación Biobalística en Pino radiata. Uno de los objetivos que sepropuso alcanzar Fundación Chile con este proyecto fue desarrollar y fortalecerlas capacidades nacionales que permitiesen obtener productos biotecnológicos deaplicación comercial en el área forestal. Las capacidades de producir líneasclonales usando Embriogénesis Somática, base para transformación, se obtuvodesde Canadá y profesionales chilenos han sido capacitados tanto en este paíscomo en Nueva Zelanda. Hoy se dispone, en criopreservación, de más de 500 líneasde Pino radiata, parte de las cuales se pretende evaluar en ensayos de campodurante la próxima temporada de plantación.
Embriones Somáticos de Pinus radiata

Con el auge en el desarrollo biotecnológico de los últimosaños, que se ha hecho extensivo a la industria forestal, actualmente es posibleaplicar novedosas técnicas de micropropagación como Embriogénesis Somáticaobteniendo plantas transgénicas de Pinus radiata. La transformación de coníferases relativamente reciente. El uso de métodos de transformación basados enprincipios físicos, como en sistemas biológicos mediante Agrobacteriumtumefaciens (At) ya han sido utilizados en varias especies forestales. MedianteBiobalística, un sistema que consiste en disparar DNA a la célula vegetal, sereportó en 1991 la transferencia directa de genes en coníferas.Posteriormente, este método ha permitido transformar y regenerar plantas dePicea, Larix y Pinus radiata. Recientemente, se ha descrito el co-cultivo detejido embriogénico (TE) de Pinus strobus con At. La aplicación de talprocedimiento permitió la obtención de aproximadamente 50 líneastransformadas, de las cuales se regeneraron plantas completas.

Aunque en el país diversos laboratorios están intentandodesarrollar esta tecnología, se han abocado principalmente a implementar elsistema de Embriogénesis Somática (ES) para Pinus radiata produciendo in vitroembriones similares al de una semilla, pero a partir de células somáticas y node células sexuales haploides, como ocurre en la reproducción sexual.

Conscientes del rol primordial en la generación deconocimiento, en la Pontificia Universidad Católica de Chile se estádesarrollado una línea de investigación que involucra la manipulación génicade especies forestales. En este contexto, se ha establecido un sistema detransformación de TE de Pinus radiata mediante Agrobacterium tumefaciens.Produciendo embriones de P. radiata que expresan el gen reportero GUS en formaestable.

Investigadores del Laboratorio de Propagación Vegetativa dela Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad Nacional de Misiones,Argentina; han intentado determinar la época óptima de cosechas de conos yestablecimiento in vitro de embriones inmaduros de Pinus taeda, además dedeterminar el estadío óptimo de desarrollo del embrión cigótico para lainiciación de tejido embriogénico. Usando el sistema de clasificación dePullman y Webb (1994), el estadío óptimo de desarrollo del embrión para lainiciación del tejido embriogénico, corresponde a las fechas de cosechacomprendidas entre la primera y la cuarta semana de enero.

Para la Industria Forestal Argentina es de interés aumentarla disponibilidad de material genético mejorado de esta especie, siendo laembriogénesis somática una herramienta potencial para la propagación masivade material selecto. De Pinus taeda se han iniciado cultivos embriogénicos apartir de embriones cigóticos inmaduros con el megagametofito intacto cuatro acinco semanas después de la fertilización (Gupta y Durzan, 1987).

El Fondo Mundial para la Naturaleza(WWF) publicó un informeen el que subraya que, en un futuro cercano, los países latino americanos y asiáticospodrán producir arboles transgénicos, pese a la falta de investigación sobreel impacto que dicho experimento tendría sobre el medio ambiente.

En Chile, según la Dra. María Isabel Manzur, la plantaciónde árboles transgénicos está en sus comienzos, pero existen algunos proyectossobre pino y, entre otros, los que llevan a cabo:

 

• Bioforest, empresa subsidiaria de Forestal Arauco, ubicada en la VIII Región cuyo programa de investigación se centra en mejoramiento clonal de pinos. La compañía trabaja además en control biológico de plagas.

   

   

• Genfor S.A. , una sociedad entre Fundación Chile, Sylvagen de Canadá e Interlink de EEUU., creada con apoyo de CORFO, que utiliza tecnologías de mejoramiento clonal (embriogénesis somática) y creación de pino radiata transgénico que sería prontamente plantado en campos de prueba. Este pino transgénico ha sido modificado para resistencia a la polilla del brote (gen Bt), resistencia a enfermedades fungosas, manipulación del contenido de lignina y celulosa y otras características relativas a la calidad de la madera.

   

El Fondo Mundial para la Naturaleza (WWF) señala cuatroriesgos entre otros

Efectos a largo plazo: La inserción de un gen puedetener impactos colaterales en el resto del genoma huésped, produciendo efectosno previstos. La mayor parte de ellos podrían identificarse, pero en algunascircunstancias podría alterarse la conducta de genes silenciosos, que seactivan en circunstancias como extremos climáticos, ataques de insectos, etc.Como los árboles son especies de larga vida, es probable que estén sujetos aestos factores desencadenantes alguna vez en su vida.

Contaminación Genética: Cuando las plantaciones o losensayos de arboles transgénicos se realizan cerca de sus parientes silvestres,la probabilidad de contaminación genética es alta. Por ejemplo, el polen depino puede viajar a más de 600 kilómetros, arriesgando contaminar a otrasespecies.

Efectos sobre la Salud Humana: Pueden producirresistencia a los antibióticos y generación de alergias En Chile, la liberaciónde transgénicos no está sometida a Estudio de Impacto Ambiental y la mayorparte de los cultivos transgénicos se liberan sin cuarentena de bioseguridad.

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO

 

• El cultivo in vitro se puede definir como el cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, explantos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores.

   

   

• Existen diferentes tipos de cultivo in vitro; estos tipos de cultivo son: Cultivo de plantas intactas, cultivo de embriones, cultivo in vitro de un órgano aislado, cultivo de callo, cultivo de células aisladas y cultivo de protoplastos. También se definen otros tres tipos de cultivo in vitro en plantas superiores: Organizado; No organizado; No organizado/Organizado.

   

   

• El crecimiento y desarrollo in vitro de una planta está determinado por una serie de factores: La constitución genética de la planta; Nutrientes: Agua, macronutrientes, micronutrientes y azúcares, Factores físicos que influyen sobre el crecimiento: luz, temperatura, pH, concentraciones de O₂ y CO₂.

   

   

• La mayor desventaja de algunos métodos de propagación vegetativa in vitro (formación de vástagos adventicios, cultivo de callos, cultivo de células en suspensión, cultivo de protoplastos) consiste en el riesgo de que se produzcan mutaciones y variaciones genéticas.

   

   

• Hoy en día, en nuestro país, la propagación in vitro, embriogénesis somática y organogénesis son las principales técnicas de propagación vegetativa para árboles de interés forestal.

   

   

• En el caso de las coníferas, sobre todo en especies del género Pinus, es difícil la regeneración de plantas viables a partir de los protoplastos por lo que la organogénesis es la forma principal de regenerar Pinaceas in vitro.

   

   

• La influencia del material vegetal sobre el crecimiento y desarrollo se resume en: genotipo-edad de la planta, edad del órgano o tejido, estado fisiológico, estado sanitario, efecto del tiempo atmosférico, condiciones de crecimiento, posición del explanto dentro de la planta, tamaño del explanto, tipo de lesión, método de inoculación, efecto nodriza, preparación.

   

   

• El tiempo de desarrollo, desde el laboratorio hasta el campo, para todos los tipos nuevos de cultivo de tejidos o árboles GM será generalmente de diez o más años. Aunque los científicos y los administradores forestales tendrán así tiempo para evaluar muchas de las cuestiones que se plantean en la agricultura, las realidades económicas de generaciones relativamente largas seguirán siendo un grave inconveniente para los inversores en biotecnología de árboles forestales. Parece pues que la modificación genética se hará realidad solo para determinados rasgos nuevos y valiosos en especies de rotación corta de plantaciones en explotación intensiva. Es probable que la resistencia a herbicidas sea el primer rasgo para que la modificación genética resulte económicamente viable, pero incluso en este caso podrán transcurrir varios años antes de una utilización en gran escala.

   

   

• Toda biotecnología moderna requiere grandes inversiones en investigaciones y desarrollo. La asignación de fondos, a través de organismos públicos o privados, tiene que repetirse equilibradamente entre el fomento de la capacidad y los conocimientos científicos y el apoyo a tecnologías forestales más aplicadas y bien experimentadas (Burdon. 1994). La inversión y el uso de cualquier biotecnología tienen que evaluarse caso por caso, considerando cada tecnología en su específico contexto ecológico, político y económico.

   

   

• El público debe confiar en que el marco reglamentario existente no permite que el desarrollo comercial de la biotecnología se imponga sobre los aspectos de bioseguridad.

   

 

• La participación gubernamental en el desarrollo de la biotecnología parece necesaria para mantener cierto caudal de material y conocimiento en el dominio publico. De otro modo, los costos del uso de genes de propiedad privada podrían limitar gravemente el interés por proseguir el desarrollo de la tecnología de modificación genética en los árboles. Con todo producto nuevo surgen preocupaciones frente a los monopolios, pero los gobiernos pueden intervenir y así lo han hecho en caso de falta de equidad o de comportamiento empresarial que perjudiquen al conjunto de la sociedad.

   

   

• Aun cuando en el futuro no se utilicen en gran escala árboles GM, la investigación y el desarrollo en esta tecnología aportara mucha información sobre los genes y su regulación, que podrá ser muy valiosa a largo plazo para los programas convencionales de mejora genética.

   

   

• Otras decisiones sobre ordenación forestal con consecuencias ecológicas potencialmente mas grave, como las introducciones de especies en gran escala o el uso inadecuado de procedencias o árboles mejorados incluso por procedimiento convencionales, tienen que ser evaluadas por los técnicos forestales, los administradores y los organismos reguladores de la misma manera que los productos de la biotecnología moderna.

   

Universidad De Concepción

Facultad De Ciencias Forestales

Departamento de Silvicultura

Ingeniería Forestal