Indice

1. Introducción.

2. Revisión Bibliográfica.

3. Impacto ambiental de la aplicación de fertilizantes nitrogenados.

4. Importancia del cultivo.

5. Procesos de fijación de N2 atmosférico.

6. Azotobacter  sp. diazótrofo no simbiótico.  

7. Producción  de sustancias fisiológicamente activas y aplicación práctica de Azotobacter  sp.

8. Fijación simbiótica de N2 atmosférico.

9. Características de Rhizobium  sp.

10. Factores que afectan la nodulación y la fijación de N2 en las leguminosas.

11. Aplicación práctica de Rhizobium sp. en cultivos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.).

12. Aplicación de la inoculación combinada de bacterias fijadoras de N2 atmosférico.

13. Componentes del rendimiento.

14. Impacto económico-ambiental.

15. Conclusiones.

16. Bibliografía.

1. Introducción.

Un puñado de tierra contiene billones de microorganismos, son tantos tipos diferentes que se desconocen las cantidades exactas. Actualmente conocemos algunos de ellos; sólo se han descrito formalmente alrededor de 500 microorganismos no-eucariontes, lo que contrasta con las 500 000 especies de insectos ya descritas. Se conoce muy poco de la Microbiología, a pesar de que es la parte de la Biología que se proyecta más ampliamente hacia el mantenimiento de la vida en el planeta (Anónimo, 2001 b).

De los elementos del suelo el nitrógeno es el más necesario para el desarrollo y sobre vivencia de las plantas, este es el que presenta más transformaciones microbiológicas y por consiguiente el que más comúnmente se encuentra deficiente en el suelo, contribuyendo a la reducción de los rendimientos agrícolas en todo el mundo (Anónimo, 2001 a).

Las principales  formas de mantener suficiente nitrógeno en el suelo es mediante la aplicación de fertilizantes nitrogenados y las formas de fijación biológicas, pero debido al alto costo de los fertilizantes nitrogenados, la gran cantidad de energía requerida para su producción y las capacidades subóptimas para su transportación limita su uso en países subdesarrollados, especialmente en comunidades agrícolas pequeñas (Anónimo, 2001 a).

En el mundo desarrollado la agricultura depende en gran medida del uso de fertilizantes químicos y pesticidas para mantener sus altas producciones agrícolas, sin tener en cuenta los terribles daños que estos pueden ocasionar ya sea afectando el ciclo global del nitrógeno, contaminando las aguas subterránea y superficiales, incrementando los riesgos de intoxicaciones químicas y aumentando los niveles de óxido nitroso (N₂O) atmosférico; el cual es un potente gas invernadero. El uso de nitrógeno sintético en los últimos 40 años ha aumentado de 3.5 millones a 80 millones de toneladas, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, incrementándose sus costos de producción a más de  $ 20 billones USD anualmente. Para el año 2050 la población mundial se espera crezca el doble de la cifra actual de habitantes, de esta proyección el 90% debe residir en las regiones tropicales o subtropicales de los países en desarrollo de Asia, África y América Latina.  Según estos datos, es razonable esperar que la necesidad de fijación de N₂ para la producción de alimentos  agrícolas para esta fecha también duplique la cifra fijada actualmente. Si esta es suministrada por fuentes industriales, su uso se incrementará en 160 millones de toneladas de nitrógeno por año; lo que requerirá quemar más de 270 millones de toneladas de energía para su producción, sin tener en cuenta la duplicación de las fatales consecuencias que pudieran ocasionar (Anónimo, 2001 a).

Los procesos naturales de fijación biológica del N₂ (FBN) juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos  con su consiguiente efecto benéfico al ciclo del nitrógeno, el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales. Este proceso depende básicamente de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas (Anónimo, 2001 a).

Existen algunas especies de microorganismos que poseen la habilidad de convertir el dinitrógeno atmosférico (N₂) a amonio (NH₄⁺) mediante la acción de la enzima nitrogenasa. Estas especies son denominados diazótrofos y requieren de energía para realizar su metabolismo. Dentro de los diazótrofos capaces de realizar este proceso se encuentran los denominados fijadores de vida libre, los cuales fijan N₂ atmosférico sin la cooperación de otras formas vivas,  siendo la familia Azotobacteriaceae la que agrupa uno de los géneros más importantes utilizados en la biofertilización a diferentes cultivos. El género Azotobacter es uno de los microorganismos utilizados como biofertilizantes que más se aplica e investiga en Cuba. Sus propiedades beneficiosas se ponen de manifiesto en una gran variedad de hortalizas, granos y viandas (Mayea et al., 1998). FAO (1995) reporta que este se considera de menor importancia agrícola por incorporar modestas cantidades de nitrógeno al suelo, Bhattacharya y Chaudhuri (1993) reportan que es capaz de fijar de 20 a 30 kg. de N ha^-1 año,  pero tanto Azotobacter como Azospirillum en determinadas condiciones su efecto beneficioso no se debe solamente a la cantidad de N₂ atmosférico fijado, sino  a la capacidad de producir vitaminas y sustancias estimuladoras del crecimiento (ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas y vitaminas) que influyen directamente en el desarrollo vegetal (Rodelas, 2001).

Otro grupo de microorganismos que se convierten en fijadores de N₂ cuando viven en asociaciones simbióticas con organismos superiores de vida son las bacterias pertenecientes al género Rhizobium, las cuales establecen relaciones simbióticas con plantas leguminosas (Bauer, 2001).

Entre los diferentes sistemas biológicos capaces de fijar N₂ atmosférico, la simbiosis Rhizobium-leguminosa constituye con la mayor cantidad aportada al ecosistema y a la producción de alimentos (Burdman et al., 1998). Aunque hay diversas asociaciones que contribuyen a la fijación biológica del N₂, en la mayoría de lugares agrícolas la fuente primaria (80%) del nitrógeno fijado biológicamente ocurre a través de dicha simbiosis (Anónimo, 2001 b). Se estima que esta puede oscilar entre 200 y 250 kg. N ha^-1 año (FAO, 1995), calculándose que puede alcanzar el 20 % de la cantidad fijada anualmente sobre el planeta, constituyendo la asociación más elaborada y eficiente entre plantas y microorganismos (Burdman et al.,1998).

Dentro de las especies que establecen relaciones simbióticas con esta bacteria se encuentra el frijol común (Phaseolus vulgaris L.), la cual es la legumbre más importante para el consumo humano en los países del tercer mundo, pero a su vez es la especie de más baja capacidad de nodulación y fijación de N₂. Este cultivo en nuestro país ha sido durante muchos años una práctica común del campesinado, cuya producción cumplimentó en  determinado grado las necesidades del país. Actualmente la producción es insuficiente, aproximadamente 0.63 t ha^-1, como resultado del nivel de vida de la población y su poca intensificación. Durante varios años la producción de este grano ha estado limitada a las pequeñas producciones del agricultor privado, por lo que el Estado ha tenido que invertir $ 400 (USD) para adquirir una tonelada de frijol mediante la importación de este alimento para el consumo de la población. Resulta obvio que aumentar el uso y mejorar el manejo del N₂ fijado biológicamente por esta leguminosa es una meta importante para la agricultura tanto por razones humanitarias como por razones económicas (FAO, 1995; Burdman et al., 2000; Quintero, 2000).

En los últimos 20 años se han realizado ingentes esfuerzos por parte de científicos e investigadores en todo el mundo con el fin de llevar a cabo una mayor eficiencia en la fijación de N₂ por parte de la simbiosis Rhizobium-leguminosa en el cultivo del frijol, basados en las herramientas y perspectivas moleculares de las secuencias génicas y la trangénesis de plantas, alternativas que atentan contra la biodiversidad, sin tener en cuenta los estudios sobre la bioquímica de las asociaciones microbianas, los que han abierto un nuevo horizonte que está cambiando la percepción de la diversidad microbiológica.     Los efectos agronómicos de los experimentos de microorganismos asociados a la rizosfera de las plantas conjuntamente con los simbióticos han promovido un sistema de estudios para la mayor comprensión de las comunicaciones entre plantas y microorganismos Estos constituyen una fuente básica para la utilización de la fijación biológica del N₂ con el fin de mejorar la productividad de los cultivos incluyendo los microorganismos fijadores de nitrógeno asociados a la rizosfera,  como Azotobacter y Azospirillum; y aquellos que viven en estrechas relaciones simbióticas con las plantas, tales como: Rhizobium sp., Azolla sp. y endo / ectomicorrizas (Fisher y Long 1992, citado en Anónimo, 2001 a).

Objetivos.

ü        Analizar los efectos de la inoculación combinada de Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli y Azotobacter chroococcum en la fijación de N₂ y el rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris).

ü        Comparar dos dosis de inoculación del biopreparado comercial de Rhizobium.

2. Revisión Bibliográfica.

Ciertos microorganismos del suelo pueden incrementar la disponibilidad de nutrientes para las plantas, otros producen compuestos como vitaminas, hormonas y antibióticos que contribuyen a la salud vegetal y a la obtención de altos rendimientos. El hombre con el desarrollo tecnológico aplicó métodos microbiológicos para estudiar estos microorganismos y utilizarlos posteriormente, bajo el nombre genérico de biofertilizantes, en las prácticas agrícolas contemporáneas. (Compagnoni, 1997;  Guet, 1997).

A partir de la década del 40, millones de toneladas de nitrógeno sintético era suministrado a las producciones agrícolas anualmente, con el fin de aumentar sus rendimientos potenciales. La alta demanda de alimentos fue otro factor determinante de la sustitución de los fertilizantes nitrogenados por los procesos de fijación biológica del N₂. La “revolución verde” se convirtió en el punto sublime de la producción y aplicación de los mencionados fertilizantes nitrogenados, trayendo consigo el gasto incalculable de fuentes de energía natural para su producción y los nefastos problemas que ha ocasionado en la ecología y el equilibrio biológico. Desde 1972, con la fundación de la IFOAM (Internacional Federation of Organic Agriculture Movements)  se estableció que la agricultura orgánica  debía aumentar la fertilidad de los suelos y su actividad microbiana e incrementar el reciclaje de los nutrientes. En la década de los 90, los biofertilizantes se convirtieron en un punto común de investigación teniendo en cuenta los serios problemas ambientales causados con la aplicación irracional de los fertilizantes químicos (IFOAM, 2001).  

3. Impacto ambiental de la aplicación de fertilizantes nitrogenados.

El uso de nitrógeno sintético en los últimos 40 años ha aumentado de 3.5  millones a 80 millones de toneladas, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, incrementándose sus costos de producción a más de  $ 20 billones USD anualmente (Hardy, 1993, citado en Anónimo, 2001 a). En este periodo, el ciclo global del N₂ se ha visto afectado por el incremento irracional de la fijación de N₂ mediante procesos industriales, es decir, mediante la aplicación de fertilizantes nitrogenados; pero su impacto ambiental aun está por calcularse.

La contribución de la fijación de N₂ al ciclo global  de este elemento no ha cambiado en los últimos años, teniendo un balance aproximado con el proceso de desnitrificación, el cual convierte el nitrógeno combinado en N₂ atmosférico. En la actualidad la fijación no ocurre eficientemente debido a que es inhibida por la presencia de nitrógeno mineral en el medio (Vitouseck y Matson, 1993, citado en Anónimo, 2001 a). Según estos autores, alrededor del 50 % de los fertilizantes nitrogenados aplicados a los cultivos es absorbido por las plantas, el otro 50 % o más es almacenado en el suelo para la nutrición de los cultivos subsiguientes; pero una gran parte de este es transformado en N₂ atmosférico mediante los procesos de desnitrificación de los microorganismos y otra gran parte es lixiviado a capas inferiores donde contaminan las aguas subterráneas y el manto freático en forma de nitratos (NO₃). En Iowa el incremento del contenido de NO₃ en aguas subterráneas desde 1950 a 1980 ha sido paralelo al incremento del uso de fertilizantes nitrogenados.

El óxido nitroso (N₂O) es otro gran factor contaminante producto al excesivo uso de fertilizantes nitrogenados, este conjuntamente con el CO₂, metano (CH₄) y los clorofluorcarbonos es un gas invernadero causante en gran medida del calentamiento global. La energía reflectiva por mole del N₂O es alrededor de 180 veces la de CO₂, lo que lo convierte en un potente gas invernáculo. El N₂O troposférico  ha aumentado potencialmente en la década del 80, conjuntamente con el incremento sustancial de la aplicación de fertilizantes sintéticos. Por  otro lado la desnitrificación del NO₃ produce cerca del 90 % de N₂ y 10 % de N₂O, al aumentar la cantidad de nitrógeno en el suelo producto de su uso indiscriminado, aumenta este proceso de desnitrificación y por consiguiente los niveles de toxicidad en la atmósfera. Hoy día la cantidad global de este compuesto se encuentra fuera de balance, excediendo de un 30–40 %, su concentración en la atmósfera también se incrementa 0.25 % por año (Vitouseck y Matson, 1993, citado en Anónimo, 2001 a). Esto demuestra que la producción de fertilizantes nitrogenados no solamente interviene en el agotamiento de la energía natural y el combustible fósil,  sino también genera grandes cantidades de CO₂ en su producción y contribuye sustancialmente al calentamiento global potencial.

En los próximos 50 años será necesario un incremento sin precedentes en la producción agrícola para satisfacer los niveles de insumos calóricos y proteicos para el abastecimiento a la gran población mundial; pero también es imperativo la búsqueda de nuevos métodos de producción agronómicamente y ecológicamente sustentables para proteger el entorno que soportará tal explosión demográfica (Anónimo, 2001 a).  

4. Importancia del cultivo.

Los hechos concernientes al cultivo de leguminosas varían tanto como lo hacen las especies. Con respecto a la alimentación humana, el cultivo de unas pocas especies jugó un importante rol en la historia de la raza humana. En las regiones del actual México en el 4000 A.C. ya se consumía el frijol común como importante fuente de alimento. Arvejas (Vicia sativa) y habas (Vicia faba) se han encontrado en fosas arqueológicas en el Medio Oriente, que datan del año 6000 A.C. Las migraciones, guerras y el comercio permitieron a algunas especies como el maní (Arachis hipogea) soja (Glycine max), frijol (Phaseolus vulgaris) y haba (Vicia faba) diseminarse a numerosas regiones a lo largo del mundo. Sin embargo, excepto para las semillas oleaginosas (soja y maní), las leguminosas han sufrido una recesión muy aguda, particularmente debido a la competencia de los cereales (FAO, 1995).

A escala mundial, las leguminosas aportan, en términos de nutrición humana 22% de proteínas, 32% de grasas y aceites y 7% de carbohidratos. En términos de nutrición animal aportan 38% de proteínas, 16% de lípidos y 5% de carbohidratos. Su producción mundial, con respecto a las leguminosas de grano, exceptuando la soja, sobre un total de 72 millones de hectáreas producen 47 millones de toneladas, con rendimientos de 650 kg. ha-1 (FAO, 1995). De todas las especies de leguminosas, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la  que mayor importancia tiene por su  nivel de producción  y de consumo   que presenta en el mundo. Esta constituye  una fuente de alimentación proteica importante  y habitual    para nuestra población. Este grano contiene alrededor de 20% de proteínas de alta digestibilidad, constituidas por varios aminoácidos esenciales para el metabolismo humano, entre ellos isoleusina, leusina, fenilalanina, metionina y triptófano.  Además, puede considerarse también como un alimento de alto valor energético, ya que contiene de 45 a 70 %  de carbohidratos totales. Por otra parte, aporta cantidades importantes de minerales (Quintero, 2000).

Según este autor, el frijol se ha cultivado tradicionalmente en Cuba en pequeñas explotaciones campesinas, lo que se mantiene hasta nuestros días, aunque con la estructura actual de tenencia de la tierra su cultivo se ha extendido a áreas de autoconsumo de organismos estatales de todo tipo. La siembra a escala comercial en granjas especializadas, para venta a la población a través de la red comercial del Estado, es prácticamente nula. El rendimiento promedio en nuestro país es relativamente bajo (0.63 t ha-1), comparado con Chile, Perú y Argentina, aunque similar o superior a otros países de la región. Según Rehm y Spig (1991), citado por Quintero (2000) esta especie es una de las más susceptible de las leguminosas a las enfermedades y plagas, siendo atacada fuertemente en los climas húmedos y calientes por varios hongos del complejo suelo-raíz y por varios hongos, bacterias y virus de la parte aérea de la planta.   

Este grano, dentro del grupo de las leguminosas, además de ser la más importante para la alimentación humana a nivel mundial, es la de más baja capacidad de nodulación y fijación de N₂ atmosférico, por lo que en varias regiones se recurre a su fertilización nitrogenada (Burdman et al.,2000). Está claro que aumentar la fijación de N₂ por esta leguminosa traería consigo una considerable reducción de insumos en su producción, así como el aumento en sus rendimientos potenciales.   

5. Procesos de fijación de N₂ atmosférico.

Los proceso de fijación del N₂ atmosférico, es decir, obligarlo a reaccionar con otros elementos para formar un compuesto químico que lo contenga puede lograrse mediante métodos químicos y métodos biológicos. Mayea et al. (1998) señala que los métodos químicos se basan en descargas eléctricas, donde se forma óxido nítrico el cual al reaccionar con el agua de lluvia origina ácido nítrico. Este ácido reacciona con el amoniaco (NH₃) del aire para producir nitrato de amonio (NO₃NH₄) y de esta forma mediante las precipitaciones llega al suelo una modesta cantidad de nitrógeno. Se estima que este proceso puede fijar alrededor de 10 millones de toneladas métricas de N₂ por año (Hardy, 1993, citado en Anónimo, 2001 a).

Los métodos biológicos de fijación de N₂, dependen básicamente de la capacidad de algunos microorganismos de convertir el N₂ atmosférico en formas asimilables para las plantas (NH₄+) mediante la acción del complejo enzimático nitrogenasa (Mayea et al., 1998). Según estos  autores, ciertas bacterias y algunas especies de algas verdeazules (Cianobacterias) que se desarrollan independientemente tienen la habilidad de fijar el N₂ atmosférico en sus células, dando como producto final de la fijación proteínas. Estos sistemas, ya sean de vida libre, como en simbiosis con formas superiores de vida incorporan aproximadamente 170 millones de toneladas de nitrógeno anualmente al ecosistema (González y Lluch, 1992), y es probable que esta cantidad no haya cambiado sustancialmente en los últimos años.  

6. Azotobacter  sp. diazótrofo no simbiótico. 

Las bacterias aerobias de vida libre fijadoras de N₂ más conocidas se encuentran formando parte de las familias Azotobacteriaceae, Spirillaceae y Bacillaceae. Del género Azotobacter se han descrito varias especies: Azotobacter chroococcum (Beijerinck 1901), A. vinelandii (Lipman 1903), A. agilis (Beijerinck; Winograsky 1938) y A. paspali (Döbereiner 1966); sin embargo no todas tienen características perfectamente definidas (Martínez, 1986; Mayea et al., 1998; Itzigsohn et al., 2000).

 Según González y Lluch (1992) los microorganismos del género Azotobacter se describieron por primera vez por Beijerinck en 1901, desde este momento hasta nuestros días, estas bacterias han llamado la atención de numerosos investigadores por su importancia tanto teórica como práctica. La morfología de Azotobacter ha sido y es, uno de los apartados de estudio más atractivo de este género bacteriano. Así, la citología de estas bacterias no solo se altera por las condiciones ambientales, sino que más bien varía de una forma extrema. Winogradski en 1938 observó que la presencia en el medio de cultivo de compuestos carbonados como el n-butanol daba lugar a la formación de células vegetativas normales, pero en función del periodo de incubación se originaban células cocoides denominadas quistes. Pochon y Tchan en 1948, consideraron a estos quistes como formas de reposo. Más tarde Socolofsky y Wyss en 1962, demostraron la característica de resistencia de estas formas quísticas.

Este género comprende bacterias grandes, levadurifórmes, aerobias estrictas, no esporógenas y Gram negativos; son mesófilas y su temperatura óptima de desarrollo es de 30 oC. La eficacia media en relación con el N₂ fijado por unidad de azúcar descompuesto es de 5 – 10 g, lo cual se cataloga como bajo. El pH óptimo de crecimiento es de 6 y a niveles inferiores disminuyen las cantidades de N₂ fijado y hasta puede inhibirse su actividad metabólica (Martínez-Viera, 1986; Mayea et al., 1998). La capacidad de fijación de N₂ por estas bacterias varía considerablemente en dependencia de la composición del medio, su acidez, temperatura y aireación, de la presencia de N combinado, de la naturaleza de las fuentes de carbono, microelementos y de la acción de organismos antagónicos en el medio.

El efecto de diferentes fuentes de carbono sobre la fijación de N₂ por esta especie depende de la estructura de las sustancias orgánicas y de las reservas de energía química utilizable que contiene, siendo también importantes los procesos de oxidación de la materia orgánica durante la respiración (Martínez-Viera, 1986). Según este autor, la propagación de estas bacterias está relacionada estrechamente con la presencia en el medio de suficientes cantidades de fósforo (P) y potasio (K), siendo mayor el efecto del P, cuya escasez o ausencia puede hasta inhibir el desarrollo del cultivo. Este elemento estimula el metabolismo del carbono, la multiplicación y la fijación de N₂. Las cantidades necesarias de K son menores, cuando existen altas concentraciones de este en el suelo se inhibe el desarrollo de las bacterias fijadoras, dependiendo del grado de toxicidad de la fracción aniónica de sal. Los requerimientos de microelementos son notables, el molibdeno (Mo) es esencial para la mayoría de las cepas de este género, tanto cuando crecen sobre medios libre de nitrógeno como cuando se desarrollan sobre nitratos, aunque las necesidades son mayores en ausencia de nitrógeno combinado.

Según Rodelas (2001), dentro del grupo de los fijadores de vida libre el género Azotobacter presenta la capacidad de fijar N₂ atmosférico cuando en el suelo existen suficientes cantidades de materia orgánica, ya que en suelos poco fértiles con escaso contenido de materia orgánica no se obtiene efecto agronómico positivo.

González y Lluch (1992) reportan que el género Azotobacter presenta alta capacidad de biodegradación, muy especialmente para la oxidación de compuestos fenólicos sustituidos. Este hecho resulta de especial interés, basándose en recientes observaciones que muestran como estas bacterias aumentan su actividad biológica (incluyendo la capacidad fijadora de N₂) en suelos agrícolas adicionados de residuos que poseen un alto contenido en sustancias fenólicas, pudiéndose sugerir que estos microorganismos pueden contribuir a la biotransformación de este tipo de residuos cuando se usen como fertilizantes. En este contexto estos diazótrofos están considerados por algunos investigadores como bacterias ciertamente ideales para los procesos de descontaminación de suelos agrícolas con sustancias xenobióticas.

7. Producción  de sustancias fisiológicamente activas y aplicación práctica de Azotobacter  sp.

Desde el punto de vista histórico, es Azotobacter el microorganismo que de una forma más amplia ha sido utilizado en la agricultura. Las primeras aplicaciones de estas bacterias datan de 1902, alcanzando una amplia utilización durante las décadas del 40, 50 y 60, particularmente en los países de Europa del Este (González y Lluch, 1992).

La aplicación práctica de la inoculación de este diazotrófo ha sido positiva, observándose notables incrementos en los rendimientos en diferentes cultivos, principalmente en cereales. Estos resultados obtenidos, especialmente con la inoculación de Azotobacter chroococcum y Azospirillum brasilense, no deben atribuirse exclusivamente a la ganancia de N₂ por las plantas, ya que estos microorganismos en determinadas condiciones su efecto beneficioso se debe fundamentalmente a la capacidad de solubilizar fosfatos y sintetizar sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, tales como, vitaminas y hormonas vegetales que intervienen directamente sobre el desarrollo de las plantas (González y Lluch, 1992; De Troch, 1993; Pozzon, Giogetti y Martínez, 1993; Baldani, 1997; Mayea et al., 1998; Velazco y Castro, 1999; Burdman, 2000; Itzigsohn, 2000; Rodelas, 2001). De este modo A. chroococcum sintetiza tiamina de 50–100 mg g-1 de sustancia celular seca; ácido nicotínico de 200–600 mg g-1 de sustancia celular seca y ácido pantoténico y biotina; ácido indolacético (AIA); ácido giberélico y citoquininas (Rodelas, 2001).

Según González y Lluch (1992) la producción de estas sustancias por Azotobacter, se ve influenciada por el estado fisiológico de la bacteria y por la edad de los cultivos, habiéndose demostrado que la presencia de nitrógeno combinado modifica la producción de auxinas y giberelinas. Concretamente la presencia de nitrato inhibe la liberación de auxinas, mientras que en sentido contrario incrementa la producción de giberelinas. La adición de exudados radicales de ciertos cereales colonizados por Azotobacter, determinan aumentos significativos en la producción de auxinas, giberelinas y citoquininas, siendo este efecto más evidente cuando los exudados se obtienen de plantas de más de 30 días de crecimiento.

Además de los compuestos mencionados, estos diazótrofos son capaces de sintetizar sustancias fungistáticas que, al inhibir el crecimiento de los hongos fitopatógenos del suelo, promueven indirectamente el desarrollo de las plantas, especialmente en las etapas tempranas del cultivo. Estos compuestos tienen acción sobre hongos pertenecientes a los géneros Fusarium, Alternaria, Penicillium y Rhizoctonia, variando su acción antagónica con la cepa bacteriana utilizada (Mayea et al., 1998; Rodelas, 2001). Mediante su acción conjunta, estas sustancia son capaces de estimular la germinación de las semillas y acelerar el crecimiento de las plantas siempre y cuando sea adecuada la concentración de organismos en la rizosfera de las plantas. 

Martínez et al. (1997) plantean que  el efecto de la inoculación con Azotobacter chroococcum sobre la germinación y crecimiento de plántulas de tomate (Lycopersicon esculentum) en suelos Ferralíticos Rojos resulta coincidente para todas las variedades analizadas. La población de plántulas por m2 aumentó entre 36% (Cambell-28) y 78% (CI-289-RA) respectivamente, así como la altura se incrementó en 34% (C-28-V) y 96% (Nova-2) y el diámetro del tallo entre 37% (C-28-V) y 100% (Tropical-3). El número de hojas aumentó entre 22% (Tropical-1) y 42% (Línea-94) y el peso seco de 50 plántulas entre 38% (Nova-2) y 27.6% (Tropical-3). Estos resultados indican la posibilidad de acortar el periodo que transcurre entre la siembra del semillero y el momento en que las plántulas están aptas para el transplante. Estos resultados coinciden con los analizados por Puertas y González (1999), donde al estudiar la efectividad de cepas de Azotobacter chroococcum aisladas de la rizosfera de plántulas de tomate en suelos Pardos y Vertisoles, se apreció que todas estimularon en mayor o menor cuantía, al menos uno de los indicadores del crecimiento evaluados, lo que sugiere que la producción de sustancias fisiológicamente activas, constituye un factor común a dichas cepas. Lo anteriormente planteado coincide con lo citado por Dibut et al.(1990); Rodríguez y Blanco (1994); Salazar y González (1994); Acosta et al. (1995); Dibut et al. (1995); Soria et al.(1998); Rodelas (2001). En el agrupamiento de las cepas de acuerdo con su efectividad estimuladora, no influyó su procedencia, al quedar incluidas cepas aisladas de un mismo tipo de suelo en grupos diferentes; esto unido a que la cepa aislada del Vertisol Pélico fue una de las menos efectiva sugiere que debe prestarse atención a la capacidad de adaptación de las cepas de distintos tipos de suelos, así como su poder de multiplicación en determinadas condiciones, que a su lugar de origen (Dibut et al.,1990). En este sentido Abbass y Okon (1993) encontraron similares resultados, pero con diferentes cepas de Azotobacter paspali y señalaron que la diversidad de origen no tiene que estar siempre asociada a la diversidad genética.

Hammad (1998), en estudios realizados sobre la eficiencia de la fijación de N₂ y la susceptibilidad a bacteriófagos de Azotobacter chroococcum libre y encapsulado con  alginato, en condiciones  controladas (in vitro) y bajo condiciones de campo (in vivo), en la Estación Experimental de la Facultad Agrícola de la Universidad de Minia, Egipto, demostró que en condiciones in vitro, las células encapsuladas exhibieron mayor actividad del sistema nitrogenasa que en la forma libre. El sistema de encapsulación ofreció una mayor protección a las bacterias contra sus fagos. Bajo condiciones de campo, la inoculación de plantas de maíz (Zea mays, cv Giza-2) con células encapsuladas, incrementó marcadamente la población de Azotobacter chroococcum en la rizosfera y en el rizoplano, así como incrementó significativamente el porcentaje de nitrógeno y el peso seco de las plantas en comparación con los tratamientos inoculados con células libres. En plantas inoculadas con células libres, los bacteriófagos tuvieron un marcado efecto depresivo sobre la población de Azotobacter en la rizosfera y el rizoplano, reduciendo significativamente el porcentaje de nitrógeno y el peso seco de las plantas, en comparación con plantas inoculadas con células libres en ausencia de fagos.

Varios son los cultivos en los cuales la aplicación de Azotobacter chroococcum como biofertilizante ha resultado satisfactoriamente positiva. Rodríguez y Blanco (1994) realizaron un trabajo experimental en condiciones semicontroladas en viveros de café (Coffeea arabica), demostrando que con el uso de Azotobacter chroococcum  hay una mejor uniformidad en las posturas de este cultivo, así como un mayor vigor de las mismas, las cuales en el momento de la extracción del vivero hacia el campo presentaban un color uniforme en su sistema radicular, características de posturas sanas, vigorosas y con alto valor ecológico. En este sentido González et al. (1994) al analizar los resultados de la inoculación de 8 cepas de Azotobacter sobre los parámetros de crecimiento y desarrollo de vitroplantas de piña (Anana comosa), cv Cayena lisa, durante la fase de adaptación demostraron que en sentido general todas las cepas estudiadas estimularon el crecimiento de las vitroplantas, con valores significativamente superiores al testigo, lo que permite acortar el periodo de adaptación de las mismas. En el cultivo de la yuca (Manihot esculenta) Roque et al. (1994) al analizar la respuesta a la fertilización nitrogenada y su combinación con biofertilizantes en el clon CMC-40 en suelo Ferralítico Rojo hidratado, demostraron que los mejores resultados se obtuvieron con la combinación biofertilizante-fertilización mineral, destacándose Azotobacter como biofertilizante. Los máximos rendimientos en la primera cosecha oscilaron entre 43 y 46 t ha-1, se alcanzaron al aplicar 100 kg. ha-1 de N con Azotobacter y fosforina individualmente o combinados.

En papa (Solanum tuberosum) Del Castillo y Montes de Oca (1994) estudiaron el efecto del uso de bacterias solubilizadoras de fósforo (P) y fijadores de N₂ sobre el rendimiento de este cultivo en las variedades Atlantic y Desiree de producción nacional sobre suelos Ferralítico Púrpura seleccionado con diferentes valores de pH y P soluble, donde se analizaron diferentes dosis de fertilizantes minerales a 50 y 100% con aplicación de fosforina (Fb) y Azotobacter (AZ), solos y combinados en diferentes dosis y momentos de aplicación. Los resultados obtenidos muestran que la mejor respuesta a los fertilizantes minerales se encontró con el 50%, similar a los obtenidos con solo aplicar AZ; sin embargo los mejores rendimientos se obtuvieron al combinar el 100% del fertilizante mineral con ambos biopreparados, con incrementos entre 4 y 5 t ha-1. El pH del suelo influyó en la cosecha, tanto para AZ como la Fb, con incrementos del rendimiento donde el mismo era neutro a ligeramente ácido contra el ácido entre 0.84 a 1.35 t ha-1 respectivamente; mientras cuando se combina el pH neutro con un contenido de P soluble bajo hay incrementos de 1.10 t.

Otros estudios son los efectuados con combinaciones microbianas, donde se ha podido comprobar la potenciación de la estimulación en el crecimiento y demás parámetros en las plantas con la aplicación de Azotobacter conjuntamente con hongos micorrizógenos. Un trabajo realizado a partir de vitroplantas de ñame (Dioscorea alata L.) var. Criollo Blanco, las cuales durante la fase de preadaptación fueron sometidas a tratamientos con 2 cepas de MVA (IES–12 e IES–14) inoculadas a razón de 10 g / planta e inmersión de las raíces en un biopreparado de Azotobacter sp. al 20% durante 10 minutos,  obtuvieron que la aplicación de biopreparados favorecieron los parámetros morfológicos evaluados (número de hojas, longitud del tallo y el limbo mayor, longitud del peciolo mayor y  número de ramas por plantas) al compararlos con el testigo sin aplicación, comportándose como mejor tratamiento la combinación Azotobacter al 20% más la inoculación de la cepa IES-12 (Glomus caledonicum)  (Andresson et al., 1994). Así mismo Sánchez et al. (1994) , con el objetivo de determinar el efecto de 4 cepas de hongos Micorrizógenos combinados con niveles de Azotobacter sp y 2 proporciones de humus de lombriz sobre el crecimiento de posturas de café (Coffeea arabica) producidas por el sistema de moteo con poda de raíz, determinaron que la combinación Glomus fasciculatum y Glomus pelú con Azotobacter en la proporción 5/1 mostró los mayores incrementos con respecto a la altura, el diámetro del tallo y el área foliar de las posturas, resultando superiores a los tratamientos testigos .

En este mismo cultivo Rivera et al. (1997) al analizar el efecto de la aplicación de Biostin (Azotobacter chroococcum), simple o coinoculado con MVA en suelos Ferralítico Rojo de montaña, Fersialítico Pardo Rojizo y Pardo, obtuvieron que en la mayoría de los casos la aplicación simple presentó ligeros efectos positivos cuando se comparó con la conducta del tratamiento testigo, presentando por tanto un menor efecto que los encontrados con este bioestimulador en otros cultivos, pero en ninguno de los casos logra superar los mejores efectos encontrados con la aplicación de micorrizas VA, lo cual debe ser consecuencia del tipo de asociación que se establece en cada caso. Cuando se aplicó el Biostin con MVA en condiciones de suelo de media-alta fertilidad se logró incrementar el efecto positivo de las MVA, indicando que se potencia la acción de estas y posiblemente como resultante de una interacción mutualista y complementaria entre estos microorganismos. El manejo de la coinoculación MVA-Biostin no varió los criterios obtenidos sobre la relación óptima suelo/humus, ratificándose la relación 5/1 para suelos de media-alta fertilidad. En este caso, la relación 7/1 no resultó adecuada. Sin embargo, la combinación MVA-Biostin no resultó apropiada para condiciones de baja fertilidad, donde aun con sustratos 3/1 produjo efectos depresivos en comparación con la aplicación simple de MVA.

Días et al. (2000) realizaron un estudio en suelos Ferralítico Rojo lixiviado típico de montaña y suelos Fersialítico Pardo rojizo en la zona del Escambray, con el objetivo de determinar el efecto de varias cepas de micorrizas y la inoculación de Azotobacter chroococcum en el cultivo del cafeto. Los resultados arrojaron que la inoculación simple y combinada de micorrizas y Azotobacter chroococcum, aunque por lo general resulto positiva, estuvo determinada por la riqueza del sustrato utilizada, obteniéndose en todas las variantes los mejores resultados con la relación 5:1 de suelo-materia orgánica. Con estas alternativas se logra reducir el costo de producción de las posturas de cafeto en viveros.

Según lo planteado por estos autores, la coinoculación de microorganismos en la producción de posturas de cafeto es perfectamente complementaria y eficiente; pero necesita de condiciones adecuadas para la efectividad de la simbiosis micorrízica y que esta garantice una absorción de nutrientes suficientes para satisfacer las exigencias de la estimulación. La información obtenida es explicable por interacciones que se establecen en la micorrizosfera (Höflich, Wieke y Küah, 1994) y se amplían al cafeto estos efectos obtenidos en soya (Glycine max), maíz (Zea mays), tomate (Lycopersicon esculentum) y arroz (Oryza sativa) (Rivera, 1993; Medina, 1994; Gómez, 1996; Corbera y Hernández, 1997; Corbera y Nápoles, 2000).

Según Terry et al. (2000), al analizar el efecto de la aplicación de Azotobacter chroococcum y Hongos Formadores de Micorrizas Vesículo Albusculares (HFMVA) en condiciones de organopónico en los cultivos de tomate, acelga, lechuga, habichuela y rabanito, encontraron una respuesta positiva de los cultivos a la inoculación, siendo la coinoculación (Glomus sp.-Azotobacter) la que brindó los resultados más efectivos; lo que demuestra que ambos microorganismos funcionaron de forma sinergística cuando se añadieron simultáneamente.  

8. Fijación simbiótica de N₂ atmosférico.

Dentro de los métodos biológicos de fijación del N₂ atmosférico también se encuentran las bacterias capaces de realizar este proceso en simbiosis con formas superiores de vida, específicamente el género Rhizobium, las cuales  establecen relaciones simbióticas con plantas pertenecientes a la familia Fabaceae (Bauer, 2001).

Burdman et al.(1998), plantean que entre los distintos sistemas biológicos que son capaces de fijar N₂ atmosférico, la simbiosis Rhizobium-leguminosa contribuye con la mayor cantidad de nitrógeno al ecosistema y a la producción de alimentos. Aunque hay diversas asociaciones que realizan el proceso de fijación biológica del N₂, en la mayoría de lugares agrícolas la fuente primaria (80%) del N₂ fijado biológicamente ocurre a través de dicha simbiosis (Anónimo, 2001 b). Se estima que esta puede oscilar entre 200 y 250 kg. N ha-1 año (FAO, 1995), dependiendo del nivel de fijación de la especie, del cultivo, suplemento de agua, inoculación, condiciones del suelo y la fertilidad. Se calcula que la fijación de este por las plantas leguminosas alcanza el 20% de la cantidad  total fijada anualmente sobre el planeta. Esta a su vez constituye la asociación más elaborada y eficiente  entre plantas y microorganismos, por esta razón ha sido la más estudiada hasta el momento.  

9. Características de Rhizobium  sp.

Según Mayea et al. (1998) y Martínez-Viera (1986), las especies del género Rhizobium son quimiorganotróficas y crecen mejor sobre medios complejos de 25 a 30 oC, todas las cepas utilizan glucosa, galactosa, fructosa, tiamina y pentatenato de calcio. El hierro (Fe) es necesario para la síntesis de hemoproteína, este elemento es un constituyente de la leghemoglobina, se encuentra presente en la Fe-proteína y en la Mo-Fe proteína, componentes de la nitrogenasa, así como en la ferridoxina bacteriana. A pesar de que las cantidades de este elemento necesarias para el funcionamiento eficiente de los nódulos son altas, constituye normalmente, en cantidades absolutas, una pequeña fracción del total asimilable por las plantas, por ello, cuando en las leguminosas se observan síntomas de deficiencias de Fe, podemos estar seguros de que la simbiosis no se está efectuando y se debe agregar rápidamente el elemento. La escasez de cationes divalentes (Ca y Mg) conduce a pérdidas marcadas de viabilidad. La necesidad de trazas de Co en la síntesis y funcionamiento de la vitamina B₁₂ se ha considerado como una interacción que proviene de la toxicidad del Ni o Cu. La deficiencia de cinc (Zn) tiene un efecto adverso sobre la nodulación y se observa, sobre todo, cuando hay altos niveles de fósforo.

Citado por estos autores, cuando falta molibdeno (Mo) se forman más nódulos, pero son menos  eficientes y su estructura se asemeja a la de los nódulos inactivos, la dificultad para la asimilación de Mo parece ser una de las principales limitaciones en la fijación del N₂ por el frijol, especialmente en los suelos ácidos se ha demostrado que, cuando se suministra a estos Mo y Ca, el frijol es capaz de obtener todo el nitrógeno necesario para producir 3000 kg. ha-1 de grano.

Uno de los factores más importantes en el éxito ecológico de las plantas de la familia Fabaceae es su capacidad para interaccionar con bacterias del suelo pertenecientes a los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium. En esta asociación, la bacteria induce en la planta el desarrollo de un nuevo órgano, el nódulo. Dentro de este se crea el ambiente necesario para la fijación de N₂ atmosférico por la bacteria que hace a la planta independiente del nitrógeno del suelo. La formación del nódulo implica un reconocimiento específico entre los componentes procarióticos y eucarióticos de la asociación, la invasión de la célula de la planta por las bacterias y otros muchos cambios en la estructura bioquímica de ambos organismos. El análisis genético de la bacteria ha permitido identificar más de 30 genes, cuya función es necesaria para el desarrollo de un nódulo fijador de N₂ y que no se necesitan para el crecimiento vegetativo de la bacteria (González y Lluch, 1992).

Según Aranda et al. (2000 b), la selección de cepas bacterianas con efecto aditivo se encuentra entre las tendencias actuales de la biotecnología agrícola. En respuesta a las bajas concentraciones de ión férrico en el medio, muchos microorganismos producen y secretan sideróforos. Aranda et al. (2000 c) plantean que los producidos por rizobios constituyen una opción factible para el control de agentes patógenos de los cultivos hospederos. Estos compuestos no son más que metabolitos secundarios que aparecen en la fase estacionaria del crecimiento bacteriano, los cuales desempeñan un papel determinante en el biocontrol de patógenos fungosos de la rizosfera. Estos sideróforos suprimen enfermedades fungosas por acoplamiento del hierro, convirtiéndose en factor limitante para el crecimiento del patógeno. Aranda et al. (2000 a) realizaron un  estudio en  la provincia de Holguín con el objetivo de aislar y caracterizar cepas de rizobios de diferentes agroecosistemas y seleccionar aquellas con mejores potencialidades en cuanto a la producción de sideróforos. Los resultados demostraron que todas las cepas seleccionadas y caracterizadas tenían capacidad para la biosíntesis de este metabolito. Se seleccionó la mejor cepa por especie de cultivo para la evaluación del efecto antagónico ante la cepa de Rhizoctonia solani, comprobándose la actividad antagónica de las cepas estudiadas ante el crecimiento e infección del hongo fitopatógeno.  

10. Factores que afectan la nodulación y la fijación de N₂ en las leguminosas.

Caba et al. (2001) señalan que los nódulos radicales de las leguminosas son estructuras complejas, como ponen de manifiesto los estudios histológicos y fisiológicos, cuyo desarrollo y funcionamiento están regulados principalmente por la planta, la cual controla el número de nódulos mediante un mecanismo endógeno de retroinhibición o inhibición "feedback" y que se ha llamado de autorregulación. Básicamente consiste en que, iniciado un número crítico de primordios nodulares se bloquea la división celular en el córtex radical inhibiéndose el desarrollo de nuevos nódulos. La nodulación también está controlada por factores externos entre los que el nitrato del suelo resulta de especial significación. La inhibición de la nodulación por el nitrato, una vieja cuestión en el campo de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, no es un efecto nutricional como en un tiempo se pensó, sino más complejo, implicando estadios tempranos en la ontogenia del nódulo de forma similar a la respuesta de autorregulación pero al contrario que ésta, se trata de un efecto localizado y no sistémico. Mediante injertos entre plantas de diferentes genotipos, mutantes y parentales, se ha demostrado que la señal autorreguladora procede de la parte aérea (SDI, shoot derived inhibitor). No obstante, los experimentos de escisión de nódulos han revelado un mecanismo de control adicional más tardío en el que los nódulos maduros suprimen el desarrollo de los estadios tempranos. Aunque se ha especulado con el ácido abscísico, como molécula candidata a la señal autorreguladora, lo cierto es que ésta permanece aún por identificar. Recientes revisiones sobre nodulación  dan esquemas e hipótesis para conectar las fitohormonas con la morfogénesis de los nódulos. En los nódulos radicales de diversas leguminosas se pueden detectar cuatro tipos de hormonas vegetales, auxinas, citoquininas, giberelinas y ácido abscísico todas ellas a concentraciones superiores a las existentes en las raíces vecinas. Los rizobios producen auxinas , citoquininas y giberelinas si bien no se conoce la medida en la que éstas contribuyen al balance hormonal del nódulo y por otra parte no parece que su papel en la nodulación sea muy significativo ya que mutaciones en la producción de auxinas, por ejemplo, no afectan la nodulación. Suministradas exógenamente, las fitohormonas pueden inhibir la formación de los nódulos, por lo que un posible papel inhibidor para estos reguladores podría estar en la autorregulación de la nodulación.

Otra evidencia en favor de la implicación de las fitohormonas en la organogénesis de los nódulos es el hecho de que determinadas fitohormonas o bien compuestos que bloquean el transporte, inducen la formación de estructuras parecidas a nódulos (nódulos vacíos o pseudonódulos). Inhibidores del transporte polar de las auxinas, como el ácido naftil-ftalámico (NPA), inducen la formación de pseudonódulos en las raíces de diferentes leguminosas y estas estructuras expresan diferentes nodulinas tempranas, ENOD2, ENOD12, ENOD40, etc. También se ha observado que la aplicación de citoquininas a la raíz activa la división celular en el córtex radical en varias especies y que mutantes de Rhizobium meliloti portadores de gen tzs de Agrobacterium tumefaciens, que excretan citoquininas, inducen la formación de nódulos vacíos que expresan ENOD2 en raíces de alfalfa. No obstante, la expresión de nodulinas tempranas puede no requerir la formación de estructuras nodulares como sugieren la inducción de ENOD2, en raíces de Sesbania, y de ENOD12 y ENOD40, en alfalfa por aplicación de bencil adenina (Cooper y Long, 1994, citado por Caba et al., 2001).

El funcionamiento de la planta hospedadora y el endófito puede describirse, en términos generales, como un intercambio de carbono, suministrado por la planta y el nitrógeno, suministrado por los bacteriodes formados en el tejido nodular. Adicionalmente, la estructura nodular que se forma en las raíces, provee una adecuada regulación del flujo de oxígeno. El proceso de fijación simbiótica de N₂ resulta particularmente sensible a circunstancias ambientales adversas (Arrese et al., 1999). Según estos autores, el descenso de la fijación se relaciona originalmente con una limitación de aporte de fotoasimilados a los nódulos. Sin embargo, se ha demostrado que el descenso de la actividad fijadora precede a efectos detectables sobre la fotosíntesis. Durante los últimos 15 años, la limitación de la actividad fijadora se ha relacionado con variaciones en la resistencia de la difusión de oxígeno en los nódulos; una menor disponibilidad de este elemento tendría como consecuencia una limitación en la capacidad de generar ATP por parte de los bacteroides, que serían incapaces de mantener la actividad nitrogenasa. La existencia de una capacidad, por parte de los nódulos, de regular el intercambio gaseoso, a través de la llamada barrera de difusión de oxígeno, ha contribuido al fortalecimiento de dicha hipótesis. Sin embargo se ha demostrado recientemente que el incremento del oxígeno en la rizosfera no es capaz de restaurar completamente la actividad fijadora inhibida por causas ambientales. La capacidad metabólica de los nódulos puede ser modificada debido a descensos en la actividad sacarosa sintasa, lo que conduce a una acumulación de sacarosa y una falta de sustratos respirables para los bacteroides. Como consecuencia de esta situación, los nódulos restringirían el flujo de oxígeno para evitar la inhibición irreversible de la nitrogenasa.

Luque et al. (1999) plantean que la nodulación de las leguminosas es un proceso regulado por factores internos (autorregulación) y externos (fundamentalmente nitratos) y se ha sugerido la existencia de algún componente común compartido por ambos tipos de regulación de la nodulación. Experimentos realizados por estos autores, apoyan al etileno endógeno como posible candidato mediador en el control de la formación de nódulos y en la inhibición por nitratos. En este trabajo se estudió la distribución de la nodulación en raíces de soja (Glycine max) cv Bragg y su posible relación con la biosíntesis de etileno (producción de etileno y contenido de ACC, precursor inmediato de la fitohormona en tejidos vegetales) en distintas zonas de las raíces de las plantas. Los resultados obtenidos demuestran la hipótesis anteriormente planteada. Las tasas de producción de etileno de las distintas fracciones fueron sin embargo superiores a las encontradas en raíces intactas y no se correlacionaron con los nódulos que se formaron en cada caso. En cuanto al contenido de ACC, las  diferencias entre fracciones y raíces intactas fueron menores que para las tasas de producción de etileno. Además, el contenido de ACC se correlacionó mejor con la nodulación en cada fracción y fue significativamente  mayor en las fracciones de raíces inoculadas,  especialmente a 48 h tras la  inoculación. Estos resultados coinciden  con los apuntados por Caba et al. (2001), los que señalan  que el etileno exógeno es un potente inhibidor de la nodulación pero la raíz inoculada y sobre todo los nódulos, producen significativamente más etileno que la raíz  no inoculada, siendo ese etileno de origen vegetal. El nitrato del suelo, por un  mecanismo aún desconocido, es un efectivo inhibidor de la nodulación de las  leguminosas. Paradójicamente el nitrato, un nutriente y no un estrés, incrementó significativamente la producción de etileno  en raíces de alfalfa (Medicago sativa) inoculadas  encontrándose una relación inversa  entre las    tasas de   liberación     de  etileno  y la nodulación   que  se    desarrolló    sobre         esas    raíces        sugiriendo      que                     el efecto inhibidor del nitrato podría estar mediado por el etileno. Esta hipótesis resultó fuertemente apoyada cuando al tratar plantas de alfalfa, inoculadas en presencia de nitrato, con aminoetoxivinilglicina (AVG), inhibidor específico de la biosíntesis de etileno, la liberación de etileno descendió en un 80-90% y la inhibición de la nodulación fue revertida. Adicionalmente, en este estudio, se puso de manifiesto que en condiciones de no inhibición, el tratamiento con AVG también incrementó el número de nódulos confirmando anteriores resultados para la misma y otras especies e indicando un papel inhibidor del etileno endógeno en la nodulación. Finalmente, la incapacidad de ciertos mutantes Exo de Rhizobium leguminosarum para nodular Vicia sativa ssp nigra, ha sido atribuida al etileno producido por la raíz en respuesta a la inoculación (Caba et al., 2001).

Así mismo, Caba et al. (1999) plantean que la producción de etileno se incrementa significativamente en las raíces de leguminosas inoculadas, así como también la  aplicación de etileno exógeno inhibe la nodulación, y el tratamiento con inhibidores de la formación o la percepción del etileno favorece la formación de nódulos radicales. Según estos autores un estudio sobre el efecto del etileno exógeno aplicado en diferentes situaciones sobre la nodulación del mutante de soja nts 382 y el parental Bragg en condiciones controladas, tratadas con etileno en forma de ACC, demostraron que el efecto inhibidor del etileno se ejerce en un estadio temprano del desarrollo del nódulo y que los meristemos que progresan crecen y se desarrollan más rápidamente, dando nódulos con una mayor masa. La inhibición de la nodulación en las diferentes situaciones estudiadas fue siempre considerablemente mayor en el parental Bragg respecto al mutante nts, sugiriendo una mayor sensibilidad al etileno en este último. A nivel de planta entera, sin embargo, no se encontraron diferencias significativas apreciables en la capacidad para responder al etileno entre ambos genotipos.  

11. Aplicación práctica de Rhizobium sp. en cultivos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.).

Martínez-Viera (1986), reporta que la respuesta a la inoculación del frijol en condiciones de campo es variable, y son frecuentes las respuestas negativas. En trabajos realizados se han obtenido aumento en los rendimientos hasta de 98.6 % con tres cepas de seis probadas. El crecimiento de las plantas fue similar al de lotes que recibieron 50 t de N ha-1, mientras los lotes no inoculados mostraron síntomas claros de deficiencia. En lo que respecta a la fijación, se han reportado cantidades de reducción del acetileno en las plantas hasta de 30 mol C₂ H₄ h-1 considerándose comunes en las simbiosis efectivas cantidades superiores a 20 mole. A pesar de estos resultados que indican una elevada efectividad de la simbiosis se han reportado notables porcentajes de plantas noduladas sin inoculación en distintas regiones, tales como en el Medio Oeste de Estados Unidos, al igual que en Río Grande do Sul y  Sao Paulo (Brasil), principalmente en cultivos comerciales de frijol (Phaseolus vulgaris). En Cuba el porcentaje de plantas no inoculadas con nódulos ha oscilado entre 15 y 25 %. Esta nodulación natural no significa efectividad en la fijación, como lo indica el hecho de que en una evaluación de 85 cepas aisladas de nódulos formados naturalmente en plantas de frijol, solo 14 % fueron eficientes, 69 % moderadamente eficientes y 17 % ineficientes.

Según González y Lluch (1992), con la aplicación de Rhizobium en suelos con bajo contenido de nitrógeno se puede aumentar los rendimientos de plantas leguminosas. Sin embargo los inoculantes para leguminosas no se ha demostrado que sean efectivos en suelos con razas autóctonas, una limitación de este sistema es la competición. Inóculos preparados con razas muy efectivas en la fijación de N₂ se ha visto que son incapaces de formar una proporción significativa de nódulos en situación de campo por la competición con las cepas autóctonas.

Arcocha et al. (1994) señala que la respuesta del cultivo del frijol a la inoculación con cepas comerciales de Rhizobium ha sido inconsistente, por lo cual se hace necesaria la evaluación de nuevas cepas, además de evaluar el efecto de la fertilización inorgánica con fósforo (P) sobre estas. En estudios realizados sobre la inoculación de cepas de Rhizobium contra fertilización química en frijol ejotero, demostraron que al evaluar 7 cepas experimentales de biofertilizantes Mexicanos y una comercial (Nitrobiol) bajo una dosis constante de P (40 kg. ha-1), incluyendo 3 tratamientos adicionales resultantes de la combinación de 60 kg. ha-1 de N y 40 kg. ha-1 de P, más un testigo, obtuvieron una respuesta positiva con el uso de este biofertilizante. Las variables medidas fueron: rendimiento de  ejotes, peso de nódulos, número de nódulos, peso del follaje y peso de la raíz. Los rendimientos obtenidos con la cepa más sobresaliente  (FM 110 + P) fueron similares a los obtenidos con el tratamiento de fertilizante químico (60-40-00). Sin embargo las utilidades fueron ligeramente mayores con las cepas de Rhizobium. El efecto de las cepas analizadas se reflejó en un incremento de 2460 kg. ha-1 de ejotes en relación con los tratamientos de fertilizantes 00-40-00 y 00-00-00, y un incremento de 4478 kg. ha-1 de ejotes en relación al tratamiento 60-00-00.

Producto de la baja capacidad de formación de nódulos radicales y la escasa fijación de N₂ del frijol común, es que se recurre normalmente en países desarrollados y otros a la fertilización mineral de este. Montes (1999) señala que los fallos en la nodulación de este cultivo se deben con cierta frecuencia al alto nivel de nitrógeno residual procedente de cultivos anteriores, lo que actúa inhibiendo la formación de los nódulos. Sin embargo, los efectos resultantes de la absorción de nitratos sobre la disponibilidad de otros nutrientes no han sido valorados, habiéndose detectado deficiencias foliares de algunos nutrientes (P, B, Zn, etc.), en particular, en cultivos fertilizados con nitrógeno mineral. La absorción de nitratos lleva aparejado un aumento del pH rizosférico que puede reducir la disponibilidad de algunos nutrientes como el P. Las condiciones de baja disponibilidad de este último reducen la fijación de N₂ por efectos específicos en la iniciación y crecimiento del nódulo y la actividad nitrogenasa, así como también reduce la absorción y transporte de nitratos desde las raíces a la parte aérea de la planta. Este autor llevó a cabo un trabajo con el objetivo de evaluar la respuesta del frijol común cv. Canellini a la inoculación con Rhizobium spp. en condiciones de distinta disponibilidad de P y N, además de dilucidar algunos aspectos de la compleja interacción entre P y N, y algunos de los posibles factores limitantes a la fijación simbiótica de N₂ en este cultivo.  El efecto sobre la fijación simbiótica se estudió considerando número y tamaño de nódulos y el transporte de ureidos en savia. También se evaluó la capacidad de asimilación de NO₃ del sistema radical a través de los cambios en la concentración de aminoácidos y NO₃ en savia. Los resultados arrojaron una respuesta poco significativa de la biomasa aérea y radical al incremento de P en solución, a pesar de determinarse concentraciones indicativas de deficiencia foliar de P. Con baja concentración de NO₃ (1 mM), el incremento de P (de 0.01 a 2 mM) mejoró la nodulación y se produjo un aumento de la concentración de ureidos y aminoácidos en savia. Es de destacar la elevada concentración de NO₃ detectada en savia de plantas cultivadas con 0.01 mM de P y 1 mM de N, debida posiblemente, a una menor capacidad de asimilación de NO₃ en las raíces. Cuando la concentración de NO₃ era elevada (10 mM), los mismos incrementos de P no mejoraron la nodulación del frijol. En plantas bien noduladas  (en presencia de 1 mM de NO₃) el principal aminoácido exportado por el xilema era glutamina, y en menor cuantía aspartato y asparagina. El aumento del P incrementó de modo notable la concentración de glutamina, que junto con los ureidos, constituyen la principales formas de nitrógeno orgánico transportadas en condiciones de activa fijación simbiótica de N₂. En plantas escasamente noduladas (en presencia de 10 mM de NO₃), el aumento del P incrementó la concentración de asparagina en savia del xilema, al tiempo que reducía la concentración de NO₃.   

Resultados similares son los obtenidos por Huerta et al. (2001), los cuales al comparar el efecto de la inoculación con Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli y la fertilización nitrogenada, en la producción de biomasa, rendimiento y sus componentes en 38 genotipos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.), encontraron  que en la mayoría de los genotipos se observó mayor peso individual de semilla y número de granos por vaina con la inoculación; en contraste, la fertilización nitrogenada favoreció una mayor producción de vainas por planta y número de granos por planta, y por ende mayor rendimiento de grano y biomasa. No obstante, hubo algunos genotipos que rindieron igual al ser inoculados que al ser fertilizados.

Hernández et al. (2000) al  evaluar 200 cepas de Rhizobium, 2000 genotipos de frijol común y 4 fertilizantes fosfóricos preparados a partir de roca fosfórica nacional, en diferentes periodos y diseños experimentales según correspondiera la etapa de trabajo, obtuvieron dos cepas de Rhizobium (6bIII y 12bIII), dos genotipos de frijol común contrastantes en términos de eficiencia a la fijación simbiótica del nitrógeno y a la tolerancia al virus del Mosaico Dorado del frijol (BAT 477 y DOR 364) y un fertilizante fosfórico (PSP-50). Los tres insumos, cepas, genotipos y fertilizantes, forman parte de una tecnología integral para la producción de frijol común, la cual permite ahorrar como promedio 118 kg. N ha-1, genotipos de frijol común tolerantes al virus del Mosaico  Dorado del frijol e incrementos en los rendimientos en un 15% respecto a los rendimientos promedio tradicionales y un fertilizante fosfórico que aumenta la eficiencia de uso entre un 3 y 7%. 

La aplicación de inoculantes en suelos salinos ha sido objeto de estudio de varios investigadores. López  y González (2000) reportan que del total de suelos de nuestro país más de 1 millón hectáreas están afectadas por la salinidad, siendo el Valle del Cauto el área más significativamente afectada por esta problemática. Estos  autores realizaron un trabajo en esta zona, con el objetivo de aislar y determinar la tolerancia a la salinidad de cepas de Rhizobium  en 12 leguminosas. Los resultados demostraron una fuente importante de genes en lo referente a la tolerancia a la salinidad en cepas de Rhizobium, además de construir un paso de avance en la conservación de la biodiversidad de cepas de Rhizobium nativas de un área bajo stress salino.

Abdelkhalek et al. (1999), señalan que la disponibilidad de mutantes de Rhizobium tolerantes a la salinidad son importante para dilucidar los mecanismos de tolerancia y su relación con la eficiencia de la fijación de nitrógeno. Estos autores realizaron un  trabajo donde obtuvieron cepas tolerantes a la sal, isogénicas de la cepa de R. etli CFN42, cepa muy sensible a concentraciones bajas de cloruro sódico, y se comparó su eficiencia fijadora de N₂ en simbiosis con Phaseolus vulgaris. Se inocularon plantas de frijol común con la cepa silvestre CFN42 o sus mutantes CFNH1, CFNH5 y CFNH6, y se estudió el efecto de la aplicación de diversas dosis de NaCl a 0, 25 y 50 mM desde el inicio del cultivo, para evaluar el efecto sobre el crecimiento de la planta y la fijación simbiótica de N₂. Los parámetros determinados como peso seco de parte aérea (PSPA), peso seco de raíz (PSR) peso seco por planta (PSP), relación raíz parte aérea (RPA), peso seco de nódulos (PSN), peso normalizado por nódulos (PNN), actividad reductora de acetileno (ARA) y actividad reductora de acetileno por planta (ARAP), pusieron en evidencia una mejora en el crecimiento y en la fijación de N₂ en las plantas inoculadas con las cepas mutantes en comparación con las inoculadas con la cepa silvestre, tanto en ausencia de sal como en presencia de concentraciones intermedias de cloruro sódico. Los resultados globales indican una relación directa entre la tolerancia a la sal de la bacteria y la eficiencia fijadora de N₂ y el crecimiento de P. vulgaris en condiciones de salinidad, y ponen de manifiesto la importancia del microsimbionte en la tolerancia de la planta al estrés salino.

12. Aplicación de la inoculación combinada de bacterias fijadoras de N₂ atmosférico.

Según González y Lluch (1992), con el uso de inoculantes mixtos de Rhizobium / Azotobacter y Rhizobium / Azospirillum, se han obtenido incrementos en la nodulación de ciertas leguminosas. Sin embargo, estos tipo de inoculantes deben prepararse con ciertos requisitos previos, entre los que se destaca una relación celular adecuada, ya que la preparación aleatoria de estos puede originar efectos negativos sobre la nodulación y desarrollo de las plantas.

 Más del 15% del total de 150 000 ha de leguminosas inoculadas con Rhizobium spp. en South África han sido coinoculadas con Azospirillum brasilense. En el periodo 1999-2000, este porcentaje se ha incrementado alrededor del 50% (Burdman et al., 2000). Según estos autores experimentos de campo han demostrado incrementos en los rendimientos de 15-30 % en leguminosas coinoculadas, valores superiores a lo obtenido con la inoculación de Rhizobium solo. Estos resultados coinciden con los citados por Okon y Vanderleyden (1997), los cuales en investigaciones realizadas sobre la inoculación con Rhizobium y Azospirillum reportan un efecto positivo para diversos tipos de leguminosas, incluyendo una temprana nodulación, incrementos en el número de nódulos, altas cantidades de fijación de N₂ y un mejoramiento en general del desarrollo de sistema radical.

Según Burdman et al. (2000), la estimulación de la nodulación posterior a la inoculación de Azospirillum puede estar dada por un incremento en la inducción de raíces laterales, la densidad de los pelos radicales y las ramificaciones de dichos pelos; pero también por la diferenciación de un número mayor de células epidérmicas dentro del pelo radical infectado. No obstante estos resultados, la respuesta de la inoculación combinada de Rhizobium / Azospirillum puede tanto estimular como inhibir la formación de nódulos y el crecimiento en un sistema simbiótico dado, dependiendo del nivel de concentración de inóculo y el engranaje de la inoculación. Según reportes por estos autores, la inoculación de cereales con niveles relativamente altos de Azospirillum inhibe ligeramente el crecimiento de las raíces.    

Hasta el momento, el frijol común (P. vulgaris) es considerado la leguminosa de más baja capacidad de fijación de N₂, debido a la lenta formación de nódulos radicales por Rhizobium, lo cual contribuye a la poca cantidad de N₂ fijado para los requerimientos nutricionales de la planta (Burdman et al., 2000). Según estos autores cuando esta leguminosa es inoculada con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azospirillum brasilense, el número total de nódulos y la fijación de N₂ se incrementa significativamente en comparación con plantas inoculadas con Rhizobium solo. El crecimiento de las plantas es acelerado por la actividad estimuladora de Azospirillum, promoviendo la formación de pelos radicales y el incremento de la secreción de genes de nodulación (nod), induciendo flavonoides en los exudados radicales. La excreción de estos genes son necesarios para la posterior infección por Rhizobium. De este modo la inoculación combinada de Rhizobium y Azospirillum incrementa los rendimientos de las leguminosas bajo condiciones limitadas de agua y nitrógeno.

Burdman et al. (1996) plantea que la inoculación con Rhizobium etli TAL 182 y R. tropici CIAT 899 en el frijol común (P. vulgaris) incrementan los rendimientos de las semillas, y la inoculación combinada con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azospirillum brasilense cepa Cd ha resultado con mayores incrementos que en la inoculación con Azospirillum solo, el cual no tuvo diferencias significativas en cuanto a rendimiento con el control sin inocular, no obstante, arrojó un aumento relativo en el peso seco de los granos. Así mismo Burdman et al. (1997) reportan que la inoculación combinada en plantas de frijol común con Rhizobium y Azospirillum incrementaran significativamente tanto los nódulos activos como los totales, así como la fijación de N₂ en comparación  con la inoculación de  Rhizobium solo.

   En estudios realizados  con la inoculación de combinaciones bacterianas compatibles, formada con la cepa Rhizobium leguminosarum biovar. viceae  Z. 25 (CECT 4585) y Azotobacter chroococcum H. 23 (CECT 4435) se pudo observar como esta práctica promueve el crecimiento, la nodulación y el contenido de nitrógeno del haba (Vicia faba), bajo condiciones controladas del cultivo. En comparación con plantas inoculadas en solitario con Rhizobium, las plantas coinoculadas muestran una tendencia al aumento en el contenido total por plantas de fósforo (P) y potasio (K) así como en contenido total de calcio (Ca), magnesio (Mg) y micronutrientes (Mn, Zn, Cu, B y Fe) en la fracción correspondiente a la parte aérea de las plantas. (Rodelas et al., 1999). Estos incrementos guardan una fuerte correlación lineal con la estimulación que estos tratamientos de inoculación combinada ejercen sobre la acumulación de materia seca por planta.

Los efectos de los tratamientos de inoculación mixta sobre la concentración y contenido de minerales en Vicia faba dependen por tanto, de la cepa diazótrofa de vida libre aplicada en combinación con Rhizobium. Estos datos son acordes con los otros estudios relativos al efecto de la inoculación con Azotobacter y Azospirillum sobre la nutrición mineral de las plantas, coincidiendo en apuntar que las respuestas son específicas de cepas y varían considerablemente en función de las combinaciones cepa-planta, con cambios que afectan en cada caso de modo diferente a la concentración, contenido, distribución y balance de los distintos nutrientes minerales (Rodelas et al., 1999).

Los resultados anteriormente citados coinciden con los estudiados por Torres y Francisco (1999), al analizar el efecto de la inoculación mixta de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azotobacter chroococcum (cepa Mb-1) bajo condiciones semicontroladas en el cultivo del frijol común var. BAT-304, los cuales obtuvieron que las cepas tratadas eran compatibles a la inoculación, originando aumentos significativos en cuanto a los parámetros de fijación: número de nódulos totales y nódulos activos, en comparación con los tratamientos de fertilización mineral y el testigo, potenciando de esta forma la capacidad de formación de nódulos y la fijación de N_2. Con respecto a los parámetros morfológicos no se observaron diferencias significativas en cuanto a la altura y el peso fresco y seco del follaje en los tratamientos de inoculación combinada y la inoculación con Rhizobium en solitario, pero existió diferencias significativas en comparación con el testigo y el tratamiento con fertilización mineral, este último  presentando los mejores resultados en cuanto al peso fresco y seco del follaje, lo cual se debe al rápido efecto de la fertilización mineral sobre la nutrición de las plantas. Así mismo Torres (2000), al evaluar el efecto de la coinoculación de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azotobacter chroococcum (cepa Mb-9) en dos variedades de frijol común (ICA Pijao y CIAP-7247) bajo condiciones de campo, utilizando un diseño experimental en bloques al azar, determinó que en ambas variedades analizadas, no existieron diferencias significativas en cuanto al número de nódulos por planta en los tratamientos de inoculación combinada y la inoculación con Rhizobium solo, aunque se observó una tendencia al incremento de los mismos en el tratamiento de la coinoculación, no obstante superó estadísticamente al tratamiento testigo en este parámetro. Con respecto a los componentes del rendimiento se observó un marcado incremento en todos los parámetros evaluados en la variedad CIAP-7247, siendo el mejor tratamiento el de la inoculación combinada, con respecto a la biomasa total por planta, número de vainas por plantas, número de granos por planta, peso fresco de granos y peso seco de 100 granos, en comparación con los tratamientos de inoculación con Rhizobium solo y el testigo sin inocular.     

Materiales y Métodos.

El trabajo se desarrolló en áreas pertenecientes al Centro de Desarrollo Agrícola de las FAR, en el municipio de Santo Domingo, en el periodo del 23 de enero del 2001 al 16 de abril del mismo año, utilizándose  la variedad Guira de frijol negro.

Las características del suelo en esta zona corresponden a la clasificación Fersialítico Pardo rojizo típico, el cual presenta un contenido de materia orgánica de 2.95 %, pH de 7.2 y contenido de P₂O₅ y K₂O de 43.02 y 32.72  Meq 100 g^-1 respectivamente, una profundidad efectiva de 51–90 cm y de 2–4 % de humificación.

Se sembraron 24 parcelas de 25 m² (5 x 5 m), utilizándose un diseño experimental en bloques al azar con 4 réplicas.

Tratamientos:

1.                    Inoculación  con  Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli a razón de 150 g kg^-1 de semilla (Pérez, 2001).

2.                    Inoculación con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli a razón de 150 g kg^-1 de semilla y Azotobacter chroococcum a razón de 400 ml kg.^-1 de semilla (Stancheva et al., 1995).

3.                    Inoculación con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli a razón de 70 g kg^-1 de semilla.

4.                    Inoculación con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli a razón de 70 g kg^-1 de semilla y Azotobacter chroococcum a razón de 400 ml kg^-1 de semilla.

5.                    Fertilización mineral (testigo positivo).

6.                    Testigo (negativo).

Se utilizó el biopreparado comercial de Rhizobium el cual se produce en el Laboratorio Provincial de Suelos de la provincia de Villa Clara. El biopreparado de Azotobacter fue realizado el laboratorio de Microbiología de la Facultad de C. Agropecuarias de la UCLV, con una concentración de 10⁸ ufc ml^-1, utilizando la cepa Mb-9.

La inoculación con Rhizobium se realizó mediante la mezcla de este con la semilla 24 h antes de la siembra, utilizándose sacarosa como sustancia adhesiva, mientras la inoculación con Azotobacter se realizó por inmersión de la semilla en el biopreparado que contenía esta bacteria durante 15-20 minutos antes de la siembra.

La dosis de fertilización mineral aplicada fue de 4 t cab^-1 (0.75 kg por parcela), de la fórmula completa 9-13-17. La aplicación de este se efectuó a los 15 días de la brotación.

Atenciones culturales.

ü        10 riegos por aspersión, con normas parciales de 200 m³ ha^-1 durante 2 h cada uno.

ü        2 cultivos en calles con bueyes.

ü         Aplicación de herbicidas:

Ø        Fusilade a razón de 1 L ha^-1.

Ø        Flex a razón de 0.5 L ha^-1.

ü        Aplicación de fungicidas:

Ø        Cobre a razón de 4 kg. ha^-1.

Ø        Orius a razón de 0.5 L ha^-1.

Ø        Bayfolán a razón de 1.5 L ha^-1.

Ø        Folpet a razón de 3 kg. ha^-1.

ü        Aplicación de insecticidas:

Ø        Karate a razón de 0.5 L ha^-1.

Evaluaciones.

ü        Parámetros de fijación a los 30 días, se tomaron muestras de 20 plantas por parcelas (FAO, 1995).

v                               Número de nódulos totales.

v                               Número de nódulos activos.

v                               Peso fresco de nódulos (g).

v                               Peso seco de nódulos (g).

ü        Componentes del rendimiento a los 80 días, se tomaron muestras de 10 plantas por parcelas.

v                               Número de vainas por planta.

v                               Número de granos por planta.

v                               Número de granos por vaina.

v                               Peso fresco de vainas por planta (g).

v                               Peso fresco de granos por planta (g).

v                               Peso seco de 100 granos (g).

ü        A los 84 días se realizó la cosecha, analizándose posteriormente el rendimiento        (t ha^-1) de las diferentes variantes evaluadas.

Se realizó un análisis económico de los resultados del rendimiento agrícola para determinar la efectividad de las diferentes variantes de fertilización evaluadas y su influencia en la contaminación del medio ambiente.

Para el análisis de los parámetros de fijación se procesaron los datos mediante el paquete estadístico SPSS, utilizándose el GLM  (General Linear Model) Multivariado y la prueba de Dunnett. El análisis de los datos para los componentes del rendimiento y rendimiento se procesaron utilizándose el paquete estadístico Statgraphics plus, mediante el GLM y la prueba de Dunnett.  

Resultados y Discusión.

El análisis de los parámetros microbiológicos es una de las principales evaluaciones realizadas en cultivos de leguminosas para medir y estimar la efectividad de la inoculación y la fijación de nitrógeno.

Como se aprecia en la tabla N^o 1 al analizar el número de nódulos por planta, existe una tendencia al incremento de estos en ambos tratamientos de inoculación combinada, con diferencias significativas en comparación con el resto de los tratamientos analizados. Con respecto a la inoculación con Rhizobium solamente, tanto a 150 g (1)  como 70 g (3), no existieron diferencias significativas entre estos valores, lo que indica que en este suelo puede disminuirse la dosis del biopreparado; pero sí se observó diferencias al  compararlos con el tratamiento con fertilización mineral (5) y el testigo sin inocular (6). Estos últimos, en todos los parámetros evaluados difirieron significativamente entre ambos, y con valores inferiores a los demás tratamientos. Es de destacar el número de nódulos observados en el testigo sin inocular, aunque inferior a los tratamientos inoculados, pone en evidencia la abundancia y efectividad de las cepas autóctonas en este tipo de suelo.

                          Tabla 1. Análisis de los parámetros de fijación.

                           Letras desiguales difieren para p < 0.05.

Al analizar los nódulos activos por planta, parámetro este de gran importancia, ya que representa la efectividad de la inoculación, se puede observar como la inoculación combinada a 150 g (2) tuvo el mejor valor absoluto con diferencias significativas en comparación con el resto de los tratamientos, seguido de los valores obtenidos mediante la inoculación combinada a 70 g (4) y la inoculación con Rhizobium a 150 g (1), los cuales no difirieron estadísticamente. Los tratamientos 3  y 6 no difirieron significativamente, poniendo de manifiesto la  eficaz infectividad de las cepas autóctonas del suelo y la posible competitividad con la cepa del inóculo. González y Lluch (1992) reportan que inóculos preparados con razas muy efectivas en la fijación de N₂ se ha visto que son incapaces de formar una proporción significativa de nódulos en situación de campo por la competición con las cepas autóctonas.

En el tratamiento donde se aplicó la fertilización mineral puede corroborarse lo planteado por Vitousek y Matson (1993), citado de Anónimo (2001); Montes (1999) y Caba et al. (2001) los cuales señalan que la presencia de nitrógeno mineral en el medio inhibe la formación de nódulos radicales y la actividad de la enzima nitriogenasa.

El peso fresco de los nódulos tuvo un comportamiento similar a los resultados obtenidos en las variables anteriormente analizadas, observándose como los tratamientos de coinoculación resultaron los mejores valores superando estadísticamente a los testigos. En este parámetro también puede apreciarse la efectividad de las cepas autóctonas del suelo, al no existir diferencias significativas entre el testigo sin inocular y la inoculación con Rhizobium a 150 g kg.^-1.

Al igual que los nódulos activos, el peso seco de los nódulos es un parámetro que ejerce una gran influencia sobre la efectividad de la inoculación y la fijación de N₂. En estos resultados se evidencian como mejores valores los tratamientos 2 y 4, los cuales no difirieron significativamente entre ambos, aunque se observa como el tratamiento 4 no tuvo diferencia significativa con respecto a los tratamientos 1 y 3; pero sí al compararlos con los tratamientos 5 y 6.

Teniendo en cuenta los resultados globales del comportamiento de los tratamientos frente a los parámetros de fijación, puede observarse como la inoculación combinada con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli a razón de 150 g kg.^-1 de semilla y Azotobacter chroococcum, fue el tratamiento de mejores valores estadísticamente, lo cual puede estar dado por la compatibilidad entre las cepas bacterianas tratadas, el sinergismo entre estas y la adecuada proporción de diazótrofos en la rizosfera de las plantas, ocasionando una temprana colonización de los pelos radicales por Rhizobium, facilitado por la excreción de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal producidas por Azotobacter que influyen directamente sobre la estimulación del sistema radical de la planta, así como crear las condiciones favorables para la infección por Rhizobium y el incremento en la nodulación. Todos estos factores conjuntamente incrementarán la disponibilidad de nutrientes para los diazótrofos y los macrosimbiontes y por consiguiente se establecerán las relaciones asociativas favorables para el incremento de la fijación de N₂.

Estos resultados coinciden con los analizados por Rodelas (2001) al plantear que la inoculación de Rhizobium leguminosarum biovar viceae en combinación con cepas de Azotobacter y Azospirillum promotoras del crecimiento vegetal, modifica beneficiosamente ya sea la concentración como el contenido de nitrógeno en las plantas, además de repercutir favorablemente sobre la nodulación y la actividad nitrogenasa. De igual forma Burdman et al. (1997) plantean que al inocular Azospirillum combinado con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli en frijol común se produjo un aumento en el número total de nódulos y la fijación de N₂ atmosférico, además de una temprana nodulación.

Estos resultados están estrechamente relacionados con las interacciones establecidas entre las cepas tratadas, de esta forma se plantea que los incrementos en la nodulación y la fijación de N₂ son originados por la capacidad que tiene el género Azotobacter de producir fitohormonas y vitaminas, tales como, ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas , tiamina, ácido pantoténico, ácido nicotínico y biotina, las cuales intervienen directamente en el desarrollo vegetal y trae consigo un alargamiento y acondicionamiento de la raíz para facilitar la infección por Rhizobium y la posterior nodulación  (González y Lluch, 1992; De Troch, 1993; Baldini, 1997;  Mayea et al., 1998;  Caba et al.,1999; Rodelas,  2001).

Además de estas sustancias, el género Azotobacter es capaz de solubilizar fosfatos, haciéndolos asimilables tanto para las plantas como para los microorganismos rizosféricos, y de este modo contribuyen a crear las condiciones favorables para una buena nodulación por Rhizobium. Las condiciones de baja disponibilidad de fósforo reduce la fijación del N₂ por efectos específicos en la iniciación y crecimiento del nódulo y la actividad nitrogenasa (González y Lluch, 1992; Montes, 1999).

En cuanto a la dosis de inoculantes, la utilizada a razón de 150 g kg^-1. de semilla fue la de mejores resultados, lo que evidencia que al existir una adecuada concentración bacteriana en la superficie de los pelos radicales de la plantas y en la rizosfera, habrá una mayor infección y proliferación por parte de los diazótrofos y por consiguiente mejores resultados en la nodulación (Pérez, 2001).

13. Componentes del rendimiento.

Los componentes del rendimiento expresan una medida del comportamiento de las diferentes variantes evaluadas sobre el desarrollo y los parámetros morfológicos en esta leguminosa. En la tabla N^o 2 puede apreciarse como con respecto a los componentes del rendimiento solamente existieron diferencias estadísticas en cuanto al número de vainas por planta, número de granos por planta y número de granos por vaina, parámetros de gran influencia sobre el rendimiento. 

Tabla  2. Análisis de los componentes del rendimiento.

Letras desiguales difieren para p< 0.05

Con respecto al número de vainas y número de granos por planta, se observa como los tratamientos 2, 4 y 5 no difirieron estadísticamente entre ellos, así como tampoco se evidencian diferencias entre los tratamientos 1,3,4,5 y 6, siendo la coinoculación a 150 g el único tratamiento que difirió significativamente con respecto a las variantes 1,3 y 6. Al analizar el número de granos por vaina se observa como los tratamientos 1, 2, 4, 5 y 6 no tuvieron diferencias significativas, pero sí al compararlos con el tratamiento de inoculación con Rhizobium a 70 g, el cual obtuvo el menor valor absoluto.

Estos resultados coinciden con los analizados en los parámetros de fijación, debido que al existir una baja concentración de bacterias en la rizosfera de las plantas y a la posible competencia con las cepas autóctonas del suelo por la colonización de los pelos radicales, se afecta la fijación de N₂ y a la vez el crecimiento y desarrollo de las plantas.

Analizando los resultados de los tratamientos 2 y 4 en comparación con los obtenidos en el tratamiento 3 y el resto de las variantes, se corrobora la potenciación de la estimulación mediante la inoculación combinada sobre las diversas variables evaluadas, aspecto que coincide con lo planteado por Torres (2000), al estudiar el efecto de la inoculación combinada de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azotobacter chroococcum (cepa Mb-9) en dos variedades de frijol común (ICA Pijao y CIAP-7247), donde obtuvo un notable incremento en los componentes del rendimiento (biomasa total por planta, N^o de vainas por planta, N^o de granos por planta, peso fresco de los granos y peso seco de 100 granos) en comparación a la inoculación con Rhizobium solo y al tratamiento testigo. 

Análisis del rendimiento agrícola.

El gráfico N^o 1 representa los rendimientos obtenidos por los diferentes tratamientos analizados. Es de destacar la baja producción de granos en todas las variantes evaluadas, debido fundamentalmente al déficit de riego en el periodo crítico del cultivo, lo cual trajo consigo una notable reducción en los rendimientos. No obstante, se puede  observar  como el  tratamiento 2 obtuvo el   mejor resultado, aunque sin diferencias significativas con los tratamientos 4, 1 y 5; se aprecia una tendencia al incremento en 24.47, 21.98 y 9.22 % respectivamente con estos tratamientos. Además de ser la única variante que tuvo diferencias significativas con los tratamientos 6 y 3, los cuales obtuvieron los menores valores, teniendo incrementos con respecto a estos de 32.27 y 43.97 % respectivamente.

El comportamiento del tratamiento de inoculación combinada a razón de 150 g, es explicable mediante las relaciones sinergísticas y compatibles que desarrollan estas bacterias, así como la interacción bacteria-bacteria-planta que se establece, originando efectos positivos sobre el crecimiento y rendimiento de las plantas (Rodelas, 2001). En esta asociación el género Azotobacter es capaz de producir fitohormonas y vitaminas que influyen favorablemente sobre el crecimiento y desarrollo del sistema radical, además de aumentar la disponibilidad de nutrientes minerales asimilables para la planta, potenciando a la vez la proliferación de Rhizobium y la fijación de N₂. Resultados similares son los obtenidos por Rodelas et al. (1999) al coinocular cepas de Rhizobium leguminosarum biovar viceae Z. 25 (CECT 4585) y Azotobacter chroococcum H. 23 (CECT 4435) en Vicia faba, demostrando un incremento en el contenido total por planta de fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg), manganeso (Mn), cinc (Zn), cobre (Cu), boro (B) e hierro (Fe) en la fracción correspondiente a la parte aérea de las plantas tratadas. En este sentido Burdman et al. (1996) plantean que la inoculación con Rhizobium etli TAL 82 y Rhizobium tropici CIAT 899 en el cultivo del frijol común incrementan significativamente el número de granos por planta, mientras que la coinoculación con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azospirillum brasilense cepa Cd ha resultado con mayores incrementos en el rendimiento que con la inoculación de Azospirillum solo. Así mismo Burdman et al. (2000) plantean que la inoculación combinada con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Azospirillum brasilense incrementa significativamente el rendimiento del frijol común bajo condiciones limitadas de agua y nitrógeno,  señalando que experimentos de campo han demostrado incrementos en los rendimientos de 15 a 30 % en leguminosas coinoculadas, valores superiores a los obtenidos  con la aplicación de Rhizobium solo.

Los resultados de los tratamientos inoculados tienen una estrecha correlación con los obtenidos en los parámetros de fijación y los componentes del rendimiento, debido que al existir una mayor fijación de N₂ e incrementarse los niveles de este elemento en las plantas, se contribuye a mejorar la nutrición vegetal trayendo consigo el aumento en la producción de granos por planta.

Al analizar el resultado del tratamiento 4, el cual  no difirió con el testigo sin inocular y el resto de los tratamientos, pudo estar originado principalmente a la baja concentración de rizobios en el inoculante, efecto muy similar a lo ocurrido en el tratamiento 3, en el cual tanto la concentración de microsimbiontes como la influencia de la competitividad con las cepas autóctonas, trajo como consecuencia una importante reducción en el rendimiento. Según González y Lluch (1992) para lograr una efectiva inoculación combinada de bacterias fijadoras de N₂ debe tenerse en cuenta una relación celular adecuada, ya que la proporción aleatoria puede originar efectos negativos sobre la nodulación y el desarrollo de las plantas. En ambos tratamientos donde se aplicó dosis de Rhizobium a razón de 70 g no existieron diferencias significativas; pero puede notarse un incremento de 25.82 % en el tratamiento de coinoculación con respecto  a la inoculación con Rhizobium solo.

Respecto al tratamiento con fertilización mineral, puede observarse como este no tuvo diferencias significativas con los tratamientos 1, 4, 6 y 2, no obstante, este último presentó un valor superior a dicho tratamiento, por lo cual es recomendable, teniendo en cuenta los altos niveles de P₂O₅ y K₂O presentes en este tipo de suelo, la reducción de la aplicación de fertilizantes minerales. De esta forma se incrementaría el rendimiento en 9.22 %  como promedio y se reducirían los costos de producción. Estos resultados están en correspondencia con los citados por Arcocha et al. (1994) al señalar que es posible la sustitución de la fertilización nitrogenada por la inoculación con Rhizobium en el cultivo del frijol ejotero, donde el rendimiento se incrementó en 4478 kg.ha^-1 de ejotes con relación al tratamiento de fertilización nitrogenada. Así mismo Huerta et al. (2000) al estudiar los rendimientos de distintos genotipos de frijol común, encontraron que algunos genotipos tuvieron iguales rendimientos al ser inoculados con Rhizobium que al ser fertilizados. Hernández et al. (2000) plantean que mediante la inoculación de las cepas 6bIII y 12bIII, las variedades BAT-477 y DOR-364 y el fertilizante fosfórico PSP-50 puede ahorrarse como promedio 118 kg. de N ha^-1 e incrementos en los rendimientos en un 15 % respecto a los rendimientos promedio tradicionales en el cultivo del frijol común en Cuba.

14. Impacto económico-ambiental.

La tabla N^o 3 muestra el análisis económico realizado para producir 1 cab. de frijol común a partir de las variantes de fertilización, para el cual se tomó como referencia la fertilización mineral tradicional en contraste con la fertilización biológica con Rhizobium y Azotobacter a razón de 150 g kg.^-1 de semilla.

Es de destacar que la obtención de los fertilizantes minerales por nuestro país se realiza mediante las importaciones, ya sea de las fórmulas de fertilizantes, como de la  materia  prima  para  su  elaboración,  siendo necesaria  la  inversión  de grandes sumas de moneda libremente convertible para su adquisición o elaboración, encareciendo el proceso productivo. 

Tabla 3. Análisis económico de los métodos de fertilización para 1 cab.

Al analizar los costos de ambos métodos de fertilización, se aprecia un menor valor con la utilización de la fertilización biológica, el cual redujo este indicador en $ 12 751.81 en comparación con la fertilización mineral, lo que evidencia el beneficio por costos de los métodos biológicos y el ahorro de insumos mediante esta práctica (Anexos 4 ). En los ingresos por ventas a Acopio se observa como con el uso de la fertilización biológica se obtiene un beneficio por incrementos en la producción de $ 2 684.50 respecto a la fertilización mineral.

Los beneficios netos representan las utilidades obtenidas mediante las diferentes variantes evaluadas, por lo que al disminuir los costos de producción y aumentar los beneficios por ventas, existirá un incremento en las utilidades, observándose una diferencia de $ 15 436.31 en el tratamiento biológico al compararlo con el  mineral.

Los beneficios de la aplicación de fertilizantes biológicos no se aprecian solamente en términos económicos, sino que además se eliminarían los efectos nocivos de la fertilización nitrogenada en la absorción, asimilación y disponibilidad de diferentes nutrientes como el fósforo (Montes, 1999), así como la erradicación de la contaminación tanto atmosférica como a las aguas subterráneas y el manto freático, siendo este impacto ambiental mucho más necesario que el impacto económico.  

15. Conclusiones.

1.        La aplicación de Azotobacter chroococcum potencia la acción de Rhizobium con respecto a la eficiencia de la fijación de N₂ en el cultivo del frijol común.

2.        La coinoculación incrementa significativamente el número de nódulos activos, la fijación de N₂, los principales componentes del rendimiento y el rendimiento agrícola en comparación con la inoculación de Rhizobium solo y el tratamiento testigo.

3.        La dosis óptima para la inoculación de Rhizobium es a razón de 150 g kg.^-1 de semilla.

Recomendaciones.

1.        Estudiar la posible aplicación de Azotobacter solamente en este tipo de suelo, debido a la abundancia y efectividad de las cepas de Rhizobium autóctonas en esta zona.

2.        Inocular la semilla de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) con la combinación de 150 g kg ^–1 de semilla del inoculante Rhizobium con 400 ml kg^-1 de semilla de  Azotobacter

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Resumen

El presente trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la inoculación combinada de Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli y Azotobacter chroococcum, en la fijación de nitrógeno y el rendimiento del cultivo del frijol común (Phaseolus vulgaris L.), conjuntamente con el estudio de dos dosis de inoculación del biopreparado Rhizobium. Se analizaron seis tratamientos resultantes de las combinaciones microbianas y el biopreparado Rhizobium sin combinación, tomándose como referencia un tratamiento con fertilización mineral y un testigo. Las dosis de Rhizobium fueron a razón de 70 y 150 g kg.^-1 de semilla, mientras la dosis de Azotobacter fue a razón de 400 ml kg.^-1 de semilla. Se evaluaron los parámetros de fijación, los principales componentes del rendimiento y el rendimiento agrícola de los diferentes tratamientos, además de realizarse un análisis económico-ambiental para determinar la factibilidad de los métodos de fertilización. Los resultados arrojaron un incremento significativo respecto a todas las variables evaluadas con el uso de las combinaciones microbianas, destacándose la dosis de Rhizobium a razón de 150 g combinada con  Azotobacter, la cual aumentó significativamente el rendimiento respecto a la inoculación con Rhizobium a razón de 70 g y el testigo, y no difirió estadísticamente con la fertilización mineral. Por lo que se recomienda utilizar como alternativa de fertilización la inoculación combinada de Rhizobium y Azotobacter a razón de 150 g kg^-1 de semilla, implicando aumentos en los rendimientos, reducción en los costos de producción y la contribución al saneamiento ambiental.

Autores:

Roldán Torres Gutiérrez¹, Eleia Miguelina Soria Arteaga¹, Carlos Pérez Navarro², Juliana García

Izquierdo³

roldantg@agronet.uclv.edu.cu.

(1).Facultad de Ciencias Agropecuarias, UCLV. Carretera a Camajuaní                                                   km. 5 1/2 , Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP: 54830.

(2). Centro de Investigaciones Agropecuarias, UCLV. Carretera a Camajuaní       km. 5 1/2 , Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP: 54830.

(3).  Centro de Desarrollo Agrícola de las FAR, AGROFAR. Santo Domingo, Villa   Clara. Cuba.

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