RESUMEN
En el presente trabajo se relacionan las principales características de las Especies Reactivas del oxígeno (ERO) de interés biológico y de los sistemas antioxidantes endógenos y exógenos. Además se describe el daño oxidativo resultante de la interacción de las ERO con las principales biomoléculas.

Palabras claves: ERO, antioxidante, daño oxidativo.

DESARROLLO
1 Especies Reactivas del Oxígeno de interés biológico. Principales características.
1.1 Especies radicalarias.
Entre las especies radicalarias de mayor interés desde el punto de vista biológico, se destacan el radical anión superóxido (O2▪-), el radical hidroxilo (▪OH), el óxido nítrico (NO▪), el radical peroxilo (RO2▪) y el radical alcoxilo (RO▪).

El O2▪- se forma a partir de una molécula de O2, en presencia de una cantidad de energía suficiente que le permita adquirir un electrón adicional. Esta especie es producida por reacciones de autooxidación, por transferencia no enzimática de electrones provenientes de la reducción molecular univalente del oxígeno y por un gran número de enzimas, tales como la NADPH oxidasa, la xantina oxidasa. El O2▪- formado in vivo tiene un tiempo de vida media del orden de los milisegundos porque se dismuta por la enzima superóxido dismutasa (SOD) con una rápida constante de reacción, o por vía no enzimática, en H2O2. El O2▪- puede penetrar las membranas biológicas y causar daño a blancos específicos (Fridovich, 1989).

Además de los procesos de dismutación anteriormente mecionados, el O2▪- es capaz de reaccionar con el ácido ascórbico, con una constante de velocidad de 2,7×105 M-1×s-1 a pH=7,0 (Nishikimi, 1975). Bajo condiciones de sobreproducción y agotamiento de sus secuestradores, el O2▪- puede interactuar con los grupos –SH de las proteínas y enzimas de su vecindad e inactivarlas, además de agotar el glutatión (Brent y Rumack, 1993) e iniciar una cascada de eventos oxidativos, donde la reacción de Haber-Weiss (Haber y Weiss, 1934) juega un papel fundamental.

El ▪OH es el radical más reactivo encontrado en los sistemas biológicos (Aruoma, 1996). Tiene la capacidad de reaccionar con casi todas las moléculas biológicas con constantes de velocidad del orden de 109-1010 M-1×s-1. Se forma a partir de O2▪- y H2O2, a través de las reacciones de Haber-Weiss y Fenton (Goldstein, 1993), las que requieren trazas de metales de transición como catalizadores. Los iones de hierro son los que intervienen fundamentalmente en esta reacción in vivo (Halliwell y Gutteridge, 1989). No existen secuestradores específicos in vivo para esta especie radicalaria.

O2▪- + Fe 3+ O2 + Fe 2+
H2O2 + Fe 2+ ▪OH + OH- + Fe +3 Reacción de Fenton
O2▪- + H2O2 Fe/Cu ▪OH + OH- + O2 Reacción de Haber-Weiss

Los radicales RO2▪ y RO▪ se forman como intermediarios durante la ruptura de lípidos peroxidados en las reacciones radicalarias de la peroxidación lipídica (POL) (Aruoma, 1996). La formación de RO2▪ es el paso más importante de las reacciones de propagación en cadena durante la POL (Gardner, 1989). La peroxidación de las membranas produce pérdida de la fluidez y alteración de los gradientes iónicos (Southorn y Powis, 1988). Numerosos residuos químicos de estas reacciones, dentro de los cuales se encuentra el malonildialdehído (MDA), pueden difundir del sitio donde se producen y provocar edema, alterar la permeabilidad vascular, desencadenar la reacción inflamatoria y la quimiotaxis, estimular la fosfolipasa A2 e inducir la liberación del ácido araquidónico, con la subsiguiente formación de eicosanoides (Southorn y Powis, 1988). Entre los secuestradores más importantes de los radicales RO2▪ y RO▪ se encuentra el glutatión y la vitamina C (de fase acuosa) y la vitamina E y los β-carotenos (de fase lipídica) (Halliwell y Gutteridge, 1990).

El NO▪ es un gas incoloro que posee un electrón no pareado deslocalizado entre el átomo de nitrógeno y el de oxígeno. El NO▪ se forma in vivo a partir del aminoácido L-arginina por acción de la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS). Esto tiene lugar en las células del endotelio vascular, las neuronas y por los fagocitos activados. El NO▪ es una molécula que participa en la señalización intracelular, la neurotransmisión y modula el tono vascular (Moncada et al., 1991). El NOŸ también regula la formación de colágeno, la proliferación celular y la contracción de la herida, en modelos animales de curación de heridas (Witte y Barbul, 2002) e incrementa la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) durante la curación de heridas cutáneas (Frank et al., 1999). El NO▪ puede interactuar con el O2▪- en una reacción radical-radical para general el anión peroxinitrito (ONOO-), en una reacción que transcurre con una velocidad de 6,7×109 M-1×s-1. El ONOO- es un compuesto altamente tóxico que provoca daño oxidativo sobre las células de manera directa (Beckman et al., 1990; Radi et al., 1990) o puede descomponerse en otros productos tóxicos, que incluyen el ▪OH (Hogg et al., 1992).

1.2 Especies no radicalarias.
Las especies no radicalarias de mayor interés biológico son: el peróxido de hidrógeno (H2O2), el ácido hipocloroso (HClO), el peroxinitrito (ONOO-) y el oxígeno singlete (1O2).

El H2O2 se forma in vivo por dismutación del O2▪-, de manera espontánea o enzimática por acción de la SOD (Aruoma, 1994). A bajas concentraciones el H2O2 es poco reactivo, sin embargo, altas concentraciones es capaz de oxidar los grupos –SH de las proteínas (Grisham y McCord, 1986) y causar ruptura de las hebras del ADN. Su efecto más nocivo es la formación de ▪OH catalizado por metales de transición mediante la reacciones de Haber-Weiss y Fenton (Goldstein, 1993). Fisiológicamente el H2O2 se remueve por la acción de las enzimas GPx y Catalasa (CAT) (McCord, 2000).

El ácido hipocloroso (HClO) es un potente agente antioxidante formado por los neutrófilos activados en los sitios de inflamación, por acción de la enzima mieloperoxidasa, en presencia de H2O2 y Cl- (Aruoma, 1996). Este agente reacciona con los grupos sulfidrilos (-SH) y aminos proteicos, y puede clorar las bases purínicas del ADN. El ácido ascórbico a concentraciones fisiológicas es un poderoso inactivador de esta ERO (McCord, 2000).

2 Interacción de las ERO con los componentes celulares.
2.1 Daño oxidativo a los lípidos.
Los radicales libres de alta reactividad, como el ·OH, pueden sustraer un átomo de hidrógeno de los ácidos grasos, conduciendo a la reacción en cadena conocida como POL. Los ácidos grasos poliinsaturados son más susceptibles al ataque de los radicales libres y como consecuencia resultan oxidados. La POL ocurre en mayor medida en las membranas biológicas y en las lipoproteínas. Este evento conduce a un aumento considerable de la permeabilidad de las membranas celulares, que origina alteraciones irreversibles de las propiedades funcionales de la célula que pueden conducir a su lisis total (Sevanian y Ursini, 2000). La POL puede disminuir la fluidez de las membranas biológicas, inactivar enzimas y receptores asociados a la membrana celular y aumentar la permeabilidad al Ca2+. Este fenómeno conduce a la formación de numerosos derivados tóxicos: los hidroperóxidos, los 4-hidroxi-alquenales, el MDA y otros (Dennis y Shibamoto, 1989). La oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) constituye uno de los mecanismos que participa en la génesis de la placa ateromatosa (Salvayre et al., 2002).
2.2 Daño oxidativo a las proteínas.
Los aminoácidos más sensibles al daño oxidativo son el triptófano, la tirosina, la fenilalanina, la metionina y la cisteína (Stadtman y Levine, 2000).

En especial, el ▪OH interactúa con muchos aminoácidos, y en ocasiones genera daños puntuales a proteínas que están unidas a metales de transición (Stadtman y Oliver, 1991; Aruoma, 1994). Los aminoácidos aromáticos y el anillo de imidazol de la histidina son hidroxilados como consecuencia de su reacción con el ▪OH. Los aminoácidos de cadena alifática, como son: valina, leucina, isoleucina y prolina cuando interactúan con el ▪OH resultan peroxidados. Muchas ERO son capaces de oxidar los grupos sulfidrilos de las proteínas, lo cual conduce a su inactivación o reducción de su actividad biológica. Este efecto ha sido observado en numerosas enzimas, como: fosfofructo-quinasa, hexoquinasa, glutatión reductasa, glucosa-6-fosfatasa, adenilato ciclasa, guanilato ciclasa, proteína quinasa dependiente de AMPc, entre otras (León et al., 2004).

Otro importante daño oxidativo, que tiene lugar en las proteínas, es la oxidación de los grupos amino de los aminoácidos a grupos carbonilo. Los residuos de mayor relevancia en este tipo de modificación son: lisina, arginina, prolina e histidina (León et al., 2004). Por otro lado, el ONOO- también es responsable del daño a las proteínas por al menos tres mecanismos: 1) puede descomponerse y generar el ▪OH, 2) el ONOO- reacciona directamente con los grupos –SH proteicos y 3) puede reaccionar con los iones metálicos para generar una potente especie, el catión nitronio, capaz de nitrar muchos aminoácidos. Los residuos de tirosina nitrosilados son estables y constituyen indicadores del ataque del ONOO- a las proteínas (Simonian y Coyle, 1996).

Como resultado del ataque de las ERO se producen entrecruzamientos de cadenas polipeptídicas y fragmentación de las proteínas, perdiendo éstas su función biológica. Las consecuencias bioquímicas de las modificaciones oxidativas a las proteínas, incluyen la pérdida de la función de receptores, enzimas y proteínas de transporte, así como la generación de nuevos antígenos que provocan respuestas inmunitarias.

2.3 Daño oxidativo al ADN.
El ▪OH es la ERO principal que actúa sobre el ADN, resultando todos sus componentes susceptibles a la acción de esta especie radicalaria. Los daños fundamentales que se obtienen de esta reacción redox son: ruptura de las hebras del ADN, hidroxilación de bases y fragmentación del azúcar 2-desoxi-D-ribosa por el ataque al grupo 3´-OH (Southorn y Powis, 1988; Henle y Linn, 1997; Box et al., 2001). El ▪OH puede generarse en la vecindad del ADN, mediante la reacción de Fenton (Goldstein, 1993), a partir de los metales de transición, hierro y cobre, los cuales en condiciones de estrés oxidativo, pueden ser liberados de las proteínas que los mantienen secuestrados y a su vez unirse al ADN. Además, la movilización de Ca2+ inducida por ERO puede activar endonucleasas dependientes de este catión y provocar la fragmentación del ADN (Orrenius et al., 1989; Fernández et al., 1995).

Cuando el NO▪ se produce en exceso, esta ERO se descompone en diferentes óxidos de nitrógeno para producir daño directo al ADN, entre ellos se encuentra el N2O3, el cual promueve la desaminación oxidativa de muchas aminas aromáticas primarias, incluyendo las purinas y pirimidinas (León et al., 2004). Las consecuencias in vivo del daño oxidativo al ADN, incluyen: alteraciones estructurales del ADN, debido a mutaciones, pérdida e inserción de bases; las cuales a su vez conducen a la pérdida de la expresión de genes o a la síntesis de una proteína anormal; como consecuencia se producen alteraciones en el metabolismo y el crecimiento, así como un funcionamiento inadecuado de las vías de señalización celular; todas estas disfunciones fisiológicas conllevan al desarrollo de enfermedades, como el cáncer, al envejecimiento, e incluso pueden conducir a la muerte celular (León et al., 2004).

3 Mecanismos de defensa antioxidante.
Las sustancias antioxidantes pueden clasificarse en antioxidantes primarios, secundarios o terciarios en cuanto a la función que realizan para ejercer este tipo de actividad biológica.

Los antioxidantes primarios son los que previenen la formación de nuevas ERO. Este efecto se logra con la conversión de las ERO en moléculas menos perjudiciales, antes de que éstas puedan reaccionar; o evitan su producción a partir de otras moléculas. En este grupo se destacan las enzimas antioxidantes: SOD, GPx y CAT, así como las proteínas de unión a metales ferritina y ceruloplasmina (RANDOX, 1996, Matés, 1999).
Los antioxidantes secundarios capturan los radicales libres y evitan las reacciones en cadena. Ejemplos de ellos son: vitamina E y C, β-carotenos, ácido úrico, bilirrubina, albúmina y glutatión.

Los antioxidantes terciarios son los encargados de la reparación de las biomoléculas dañadas. En este grupo se incluyen las enzimas reparadoras del ADN y la metionina sulfóxido reductasa.

A continuación se relacionan las principales características de las sustancias antioxidantes, clasificadas en cuanto a su localización.

3.1 Mecanismos antioxidantes endógenos.
3.1.1 Enzimas antioxidantes.
Las SOD (EC 1.15.1.1) son un grupo de metaloenzimas que pueden dividirse en dos familias filogenéticas diferentes CuZn-SOD y Mn-SOD. Las SOD catalizan la conversión de O2▪- a H2O2 y O2, con una constante de reacción de 2 x 109 M-1.s-1 para la CuZn-SOD (Guiseppe, 1972; Zelko et al., 2002). En los organismos eucariotas existen tres tipos diferentes de SOD en dependencia de su localización, que en su conjunto contribuyen a regular las concentraciones de O2▪- (Marklund, 1992).

Las GPx (EC 1.11.1.9) son enzimas dependientes de selenio (Se) y son uno de los sistemas antioxidantes más importantes de la célula (Matés et al., 1999). Contienen un átomo de Se unido a un residuo de cisteína en cada una de las cuatro subunidades idénticas. La GPx tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kDa. El Se es esencial para la actividad de la enzima. Se han indentificado cinco isoenzimas de la GPx en mamíferos en dependencia de su localización (Matés et al., 1999). La GPx ejerce su acción destoxificante por la reducción del H2O2 o los hidroperóxidos (ROOH). La GPx tiene mucho mayor afinidad por el H2O2 en concentraciones relativamente bajas que la CAT. La GPx utiliza el glutatión reducido (GSH) como cofactor y es altamente específica por el mismo, por tanto, para que pueda mantenerse la actividad de esta enzima se requiere de otra enzima, la glutatión reductasa, responsable de la regeneración del glutatión oxidado (GSSG) a reducido (GSH) (McCord, 2000).

La CAT (EC 1.11.1.6) es una metaloproteína tetramérica que contiene cuatro subunidades de 60 kDa. Cada una contiene un grupo hemo. Se localiza en la matriz de los peroxisomas y en las mitocondrias, mientras que en los eritrocitos se encuentra en el citosol. Existen muchas isoformas de la CAT, la mayoría presenta Fe, pero algunas poseen Mn. Reacciona con el H2O2 para generar H2O y O2. Aunque su afinidad por el H2O2 es inferior a la que exhibe la GPx, bajo condiciones de sobreproducción, puede asumir el papel protagónico en la eliminación del H2O2 (García et al., 1994).

3.1.2 Glutatión.
El glutatión es un tripéptido, γ-glutamil-cisteinil-glicina, que se encuentra en todas las células y es el compuesto con grupos –SH más abundante en los tejidos. El GSH se sintetiza a partir de los aminoácidos precursores en el citosol de prácticamente todas las células. La disponibilidad de L-cisteína es muy importante en la síntesis del GSH. El proceso de síntesis de GSH ocurre en dos pasos y ambas reacciones requieren ATP:
L-glutamato + L-cisteína + ATP γ-glutamil-cisteína sintetasa γ-glutamil-L-cisteína
+ ADP + Pi
γ-glutamil-L-cisteína + L-glicina + ATP GSH sintetasa GSH + ADP + Pi
La γ-glutamil-cisteína sintetasa (GCS) cataliza el paso limitante en la síntesis del GSH. Está compuesta por una subunidad pesada (73 kDa) y otra ligera (30 kDa) que están codificadas por genes diferentes. En la subunidad pesada está presente toda la actividad catalítica de la GCS y la ligera es reguladora de la función de la enzima. La GCS es regulada por retroalimentación negativa por el GSH y por la disponibilidad de cisteína. La GCS es regulada además por el estrés oxidativo y el TNFα, los que incrementan su actividad. El segundo paso de la síntesis del GSH es catalizado por la GSH sintetasa, una enzima que no es regulada por el GSH y ha sido muy poco estudiada (Griffith, 1999; Anderson, 1998).
Las principales funciones del GSH son: capturar los radicales libres, servir de cofactor de la GPx, preservar los grupos –SH en proteínas al prevenir su oxidación, ser reservorio de cisteína (León et al., 2004).

3.2 Mecanismos antioxidantes exógenos.
Vitamina E es un término genérico para designar diferentes tocoferoles. De ellos el más activo y abundante es el α-tocoferol. Su estructura le permite reaccionar con los radicales libres, interactuar con los radicales lipídicos e impedir las reacciones de propagación. Como resultado se oxida a la forma radicalaria α-tocoferilo, el cual se regenera a α-tocoferol con la intervención del ácido ascórbico y del GSH (Aruoma, 1996).

La actividad biológica de la vitamina E resulta de sus propiedades antioxidantes y es importante en el mantenimiento de la integridad y estabilidad de las membranas biológicas al proteger los ácidos grasos poliinsaturados de la oxidación. El α-tocoferol es también un importante inhibidor de la formación de nitrosaminas, por su capacidad de captar el NO▪ (Muller, 1995; Aruoma, 1996).

El ácido ascórbico (vitamina C) se considera el más potente antioxidante de fase acuosa presente en los mamíferos. A pH 7,4 el ácido ascórbico está presente en un 99,95 % como ascorbato, por tanto, en condiciones fisiológicas las propiedades antioxidantes de la vitamina C se deben a esta especie, la cual una vez que interactúa con los radicales libres, se transforma en una especie radicálica (radical semidehidroascorbato) menos activa que el radical captado (Fontham, 1994; Chen y Tappel, 1995). El mismo puede eliminar O2·-, H2O2 y 1O2. El ácido ascórbico también participa en la regeneración del α-tocoferol (Sies et al., 1992). Otra función muy importante de la vitamina C es la formación y mantenimiento del colágeno, la cual es requerida para la actividad de las enzimas encargadas de la conversión de la prolina y la lisina en hidroxiprolina e hidroxilisina, las cuales son importantes en la estructura del colágeno (Kivirikko y Prockop, 1967).

El ácido ascórbico, según el pH donde se encuentre, forma un complejo redox donde media una especie radicálica (radical ascorbilo) en el equilibrio entre ácido ascórbico y dehidroascórbico. Actualmente se considera, que como consecuencia de este mecanismo, las concentraciones elevadas de ácido ascórbico pueden ser generadoras de radicales libres (Niki, 1987). Aunque existen sistemas enzimáticos capaces de regenerar el ácido ascórbico que emplean NADH (NADH semidehidroascorbato reductasa) o GSH (GSH- semidehidroascorbato reductasa), estos son mayormente intracelulares, por lo que en condiciones de estrés oxidativo, las concentraciones de ascorbato en los fluidos disminuyen rápidamente (Diplock, 1994; Fontham, 1994).

Los carotenoides, junto con la vitamina E, son los antioxidantes principales de las membranas biológicas, y en los animales se obtienen también a partir de la dieta. Entre los más comunes se encuentran: el β-caroteno, el licopeno, la luteína y la criptoxantina. Son capaces de inactivar al 1O2 y a los radicales libres. Los carotenos son especialmente reactivos con los lipoperóxidos. Su efecto antioxidante se debe a la interacción entre los dobles enlaces conjugados de la cadena insaturada y el radical. Los carotenoides, también son precursores de la vitamina A y muestran propiedades antimutagénicas y anticarcinogénicas (Edge et al., 1997).

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AUTORES
Janet Sánchez y Roberto Faure.
Grupo de Química – Farmacología – Toxicología. Dirección de Salud y Producción Animal.
CENTRO NACIONAL DE SANIDAD AGROPECUARIA (CENSA)
Carretera de Tapaste y Autopista Nacional, Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.
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