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Enfermedades abortivas en los animales domésticos etiología, diagnóstico y diferenciación

Resumen: Abortos. Patogenia. Enfermedades abortivas causadas por diversas bacterias. Campylobacteriosis genital bovina. Aislamiento de Campylobacter fetus. Listeriosis. Tuberculosis bovina. Enfermedades originadas por hongos que pueden causar abortos. Aspergilosis. Mucormicosis. Candidiasis.
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Autor: José Angel Parada

Indice
1. Abortos
2. Patogenia
3. Enfermedades abortivas causadas por diversas bacterias
4. Campylobacteriosis genital bovina
5. Aislamiento de Campylobacter fetus
6. Listeriosis
7. Tuberculosis bovina
8. Enfermedades originadas por hongos que pueden causar abortos
9. Aspergilosis
10. Mucormicosis
11. Candidiasis 
12. Bibliografía

1. Abortos

Se define como la expulsión uterina en cualquier etapa de la gestación de un feto muerto o vivo que no ha alcanzado el grado de desarrollo para ser viable. El aborto no es una enfermedad específica, sino un signo clínico de numerosas enfermedades que afectan ya sea al feto, a la placenta, al aparato reproductor de la madre o que causan enfermedad sistémica en la madre.
El aborto es sin duda el signo de dichas enfermedades que más alarma causa entre los propietarios, ya que se ven afectados por la pérdida de fetos y bajas en la producción, además de que en muchos casos la fertilidad subsecuente del animal se ve afectada negativamente.

2. Patogenia

Se considera que aproximadamente el 90% de los abortos son debidos a causas infecciosas. Los mecanismos por los cuales un agente infeccioso produce aborto son variados y dependerán del tipo de organismo infectante, el órgano que ataca o la etapa de gestación en la que actúa; muchas enfermedades sistémicas de la madre pueden resultar en aborto aún cuando los órganos reproductores no se vean directamente afectados, en éstos casos el aborto puede resultar por una marcada elevación de la temperatura materna, la cual causa hipoxia y acidosis en el feto.
De la misma forma infecciones localizadas en cualquier órgano y causadas por microorganismos Gram- pueden resultar en una endotoxemia capaz de producir el aborto debido a la capacidad que tienen las endotoxinas de inducir la síntesis de prostaglandina F2α en muchos tejidos. Ademαs, las endotoxinas causan coagulaciσn intravascular, interfiriendo con la coagulación sanguínea a nivel de la placenta.
En el caso de infecciones que afectan directamente al feto o a la placenta, el organismo responsable debe primero llegar al útero gestante. Para lograrlo es posible que siga una de las siguientes rutas:

  • Vía hemática: Es la vía más común y adquiere mayor importancia hacia el final de la gestación. El organismo infectante puede entrar al organismo materno a través del aparato digestivo (Brucella abortus, Salmonella, Leptospira, Listeria), o de la mucosa nasal o conjuntival ( Rinotraqueitis infecciosa bovina, Leptospira, parainfluenza, diarrea viral bovina); en todo aso siempre existe una bacteria o viremia materna antes de que se produzca invasión del útero, desde el cual el organismo infectante puede invadir la placenta y luego pasar al feto.
  • Vía ascendente: ésta vía de infección es más común en las fases tempranas de la gestación. Los microorganismos pueden entrar por vagina (Campylobacter, Trichomona, Corynebacterium pyogenes, ureaplasma), desde donde ascienden hacia el útero o pueden ser depositados directamente en el útero durante la cópula o la inseminación artificial.
  • Vía descendente: es la ruta más rara y consiste en el descenso de una infección desde los oviductos hacia el útero, puede ocurrir en casos de peritonitis.

Una vez que el organismo infectante llega a la placenta, se encuentran con una variedad de condiciones que favorecen su establecimiento y desarrollo en ese lugar. Por ejemplo, la tensión de oxígeno en la placenta es baja y favorece el desarrollo de organismos anaeróbicos. Además, la placenta produce algunas sustancias que estimulan el crecimiento de algunos microorganismos. La Brucella abortus, por ejemplo, es estimulada por la sustancia erithritol que se encuentra en grandes cantidades en la placenta y líquidos fetales. Esta sustancia es un carbohidrato que Brucella abortus usa como fuente de energía y que también se encuentra en vesículas seminales y testículos de los machos, lo que explica la preferencia de ésta bacteria por éstos tejidos.
El insuficiente desarrollo inmunológico del feto, y por ende de la placenta contribuye también a facilitar el establecimiento de los microorganismos infectantes.
Cuando el microorganismo llega a la placenta o feto, se pueden presentar una variedad de condiciones dependiendo de la virulencia o patogenicidad del microorganismo:

  • Si el microorganismo es de baja patogenicidad, y solo causa una ligera inflamación de la placenta, es posible que el aborto no se produzca y se lleve a cabo un parto a término, aunque probablemente seguido de una retención placentaria.
  • Si el microorganismo tiene una patogenicidad intermedia la inflamación de la placenta puede ser moderada, con focos de placentitis severa que irán extendiéndose lentamente. Este avance progresivo de la inflamación interfiere con el funcionamiento normal de la placenta, lo que causa estrés en el feto sin llegar a matarlo, como resultado del estrés la hipófisis fetal libera ACTH, la cual inicia la cascada de eventos que desencadenan en parto, y como consecuencia se produce el aborto de un feto recién muerto o el parto de un feto vivo pero inmaduro, y por tanto con pocas posibilidades de sobrevivir.
  • Si el microorganismo es de patogenicidad elevada puede matar al feto muy rápidamente, ya sea por los daños causados a la placenta o al feto mismo. En éstos casos la muerte fetal se producirá antes de que se desencadene el mecanismo del parto, por lo que muchas veces el feto morirá y permanecerá dentro del útero para convertirse bien sea en un feto momificado, en un feto macerado o en un feto enfisematoso. En algunos casos el feto será finalmente expulsado varios días después de su muerte, presentando un grado de autólisis elevado que indica que la muerte ha ocurrido tiempo atrás.

La placentitis que a menudo resulta de la infección del útero y placenta puede causar hipoxia del feto. En éstos casos es común observar que el líquido amniótico está teñido con meconio, esto es el resultado de baja oxigenación del intestino fetal, la cual causa que se incremente el peristaltismo y se relaje el esfínter anal, resultando en expulsión de meconio hacia la cavidad amniótica. Además la hipoxia estimula el reflejo respiratorio del feto, el cual comienza a hacer movimientos inhalatorios, resultando en la inhalación de líquido amniótico hacia los pulmones, lo cual resulta en neumonía fetal. Al avanzar la hipoxia el feto muere por asfixia, y en caso de sobrevivir hasta que se produzca el parto es muy posible que muera en las primeras horas después del nacimiento debido a la neumonía desarrollada durante la vida fetal.
En los casos en los que el organismo infectante invada el feto a partir de la placenta, dicha invasión puede seguir dos vías:

  • Puede penetrar al feto por vía circulatoria a través del cordón umbilical.

Cuando la infección penetra el feto vía circulatoria, el primer órgano encontrado va a ser el hígado, el cual puede sufrir necrosis, como en el caso de IBR o hepatitis supurativa, o como en el caso de infecciones por Listeria o Campylobacter fetus. Posteriormente el agente infectante invade la circulación general del feto y puede lesionar otros órganos, causando neumonía, lesiones renales o lesiones oculares.

  • Puede penetrar vía oral al tragar el feto líquido amniótico contaminado con el microorganismo infectante.

Si el agente infectante llega al feto atravesando las membranas fetales para llegar a la cavidad amniótica, el contacto de la piel del feto con líquido amniótico contaminado favorecerá el desarrollo de dermatitis o además el feto deglutirá líquido amniótico contaminado, lo que resultará en lesiones intestinales.

Causas de abortos mas comunes en animales domesticos
Infecciosas

    • Bacterias:
      • Brucelosis: Brucella abortus (bovinos), Brucella suis (cerdos), Brucella melitensis (cabras), Brucella ovis (ovinos), Brucella canis (caninos).
      • Vibriosis: Campylobacter fetus (bovinos y ovinos).
      • Salmonelosis: Salmonella abortus ovis (ovinos), Salmonella abortus equi (equinos).
      • Leptospirosis: Leptospira pomona, Leptospira gripotiphose, Leptospira icterohemorrágica, Leptospira canicola, Leptospira hardjo, (afectan todas las especies).
      • Listeriosis: Listeria monocytogenes (ovinos y bovinos).
      • Metritis contagiosa equina: Haemophilus equigenitalis.
      • Ureaplasmosis: Ureaplasma urealyticum (bovinos).
      • Streptococcus zooepidermicus (equinos).
      • Tuberculosis: Mycobacterium bovis (bovinos).
      • Esporádicamente: Escherichia coli, Corynebacterium pyogenes, Pasteurella multocida, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomona aeruginosa (en cualquier especie).
    • Hongos
      • Aspergillosis: Aspergillus spp (afecta todas las especies).
      • Mucormicosis: Rhizophus, Absidia, Mucor ( Afectan todas las especies).
      • Candidiasis: Candida albicans (equinos).

Criterios para el diagnostico de causas de aborto

La historia clínica individual es importante para el diagnóstico, pero igualmente importante es la historia clínica a nivel del hato; factores tales como incidencia de abortos, repetición de calores, cambios en el índice de concepción, edad o número de pariciones de las hembras afectadas, pueden ser de gran utilidad en la orientación del diagnóstico. Para llevar a cabo ésta parte del diagnóstico en forma apropiada es importante contar con registros confiables de todos los aspectos reproductivos del hato.

Muchas enfermedades que causan abortos presentan además otros signos a nivel de aparato reproductor, los que nos pueden ayudar a diferenciar entre enfermedades parecidas. Como ejemplo de algunos signos característicos de una enfermedad podemos citar el elevado índice de retenciones placentarias en brucelosis bovina, incremento en el número de servicios por concepción (infertilidad) en Vibriosis. En ocasiones la enfermedad que está causando abortos en las hembras causa signos característicos en los machos, como es el caso de vesiculitis y epididimitis causadas por Brucella.
Para el diagnóstico a nivel de laboratorio es necesario recordar que el aborto puede deberse a causas que afectan a la madre, a la placenta, al feto, o a una combinación de ellos, por lo que las muestras que se envíen al laboratorio deben incluir muestras de material biológico materno (suero, moco cervical o vaginal, etc.), placentario (cotiledones, líquido amniótico, etc.) y fetal (líquido abomasal, pulmones, etc).

Entre los errores mas frecuentemente cometidos por el clínico están el no dar importancia a la obtención de muestras de la madre, así como la obtención de material placentario a partir de la porción de la placenta que queda colgando por la vulva que a menudo está contaminada por materia fecal.
Antes de enviar muestras al laboratorio es importante examinar detalladamente al feto y la placenta. En el feto se deberá determinar la edad aproximada, ya que varias enfermedades causan abortos en periodos específicos de la gestación; también se deberá determinar si el feto presenta signos de haber muerto tiempo antes de ser abortado (autólisis, pigmentación), se deberá revisar al feto en busca de lesiones específicas. En el caso de placentas se deberá hacer un descripción de su condición, si están frescas, descompuestas, retenidas o hemorrágicas. Se examinará tamaño y peso de la placenta, tamaño de los cotiledones y otros factores que puedan indicarnos si la placenta estaba teniendo una función normal o alterada.
Por la naturaleza misma del problema es posible que el aborto se detecte varias horas o días después de su ocurrencia, por lo que el feto y las placentas pueden encontrarse en un estado avanzado de autólisis o putrefacción, siendo inutilizables para el diagnóstico de laboratorio. Por ésta razón es importante la utilización de pruebas de diagnóstico que se aplican a nivel del hato, no necesariamente en los animales que han abortado, y que nos pueden indicar la presencia de una enfermedad en el hato que podría explicar los casos de aborto que se hayan presentado; como ejemplo tenemos la prueba de anillo en leche para brucelosis.

3. Enfermedades abortivas causadas por diversas bacterias

Brucelosis
Producida por diversas especies de Brucella, son causadas por Brucella abortus (bovinos), Brucella suis (cerdos), Brucella melitensis (cabras), Brucella ovis (ovinos), Brucella canis (caninos). Se caracteriza por aborto al final de la gestación y cifras elevadas subsiguientes de infertilidad.

Frecuencia
Ampliamente distribuida, posee importancia económica en casi todo el mundo, sobre todo en ganado lechero. La frecuencia vería considerablemente entre países, regiones y hatos. El microorganismo puede transmitirse al hombre y causar fiebre ondulante al consumir leche infectada o entrar en contacto con animales contaminados. El microorganismo puede aislarse de muchos órganos, además de ubres y útero.

Etiología
Se han registrado infecciones por Brucella abortus en la mayor parte de las especies, pero con frecuencia sólo se observa en bovinos que pueden tener cualquier edad, pero la infección solamente persiste en animales adultos desde el punto de vista sexual.

Transmisión
Se observa la concentración más elevada de Brucella abortus en el contenido de útero gestante, en feto y membranas fetales, pudiendo ser consideradas éstas estructuras como las fuentes más importantes de infección. la enfermedad se transmite por ingestión, penetración de la conjuntiva y piel indemne y contaminación de la ubre durante el ordeño.
La ingestión de pastos u otros alimentos contaminados con secreciones de animales enfermos es el método más frecuente de propagación. En la mayoría de los casos la contaminación es directa y aunque la posibilidad de infección por medio de moscas, perros, ratas, garrapatas, calzado, trajes y otros objetos inanimados existe, sin embargo no se considera de mayor importancia en lo que se refiere a medias de control

Patogenia
Brucella abortus tiene predilección por el útero grávido, ubres, testículos y glándulas sexuales masculinas accesorias, ganglios linfáticos, cápsulas articulares y bolsas. La sustancia denominada erithritol producida por el feto y que estimula el crecimiento de Brucella abortus, ocurre normalmente en concentraciones muy elevadas en la placenta y líquidos fetales y quizá dependa de ella que se localice la infección en éstos tejidos. Al producirse la invasión del útero grávido las lesiones se inician en la pared del órgano, pero pronto es ocupada la luz del útero, dando lugar a endometritis ulcerosa grave de los espacios situados entre los cotiledones. Los líquidos fetales y cotiledones placentarios son invadidos inmediatamente después con destrucción subsecuente de las vellosidades. El aborto suele producirse hacia los tres últimos meses de la gestación, siendo el periodo de incubación inversamente proporcional a la etapa de desarrollo del feto en el momento de la infección.

Manifestaciones CLÍNICAS
El aborto después del quinto mes de gestación constituye el signo clínico cardinal de éste padecimiento, se registran casos de 2 y 3 abortos en la misma vaca, retención de placenta y metritis. Infecciones mixtas pueden producir metritis que puede ser aguda con septicemia y muerte consecutiva o crónica seguida de esterilidad.
En machos se observan orquitis y epididimitis, afección de uno o ambos sacos escrotales con tumefacción aguda y dolorosa. Los toros suelen ser estériles cuando la orquitis es aguda pero pueden recuperarse si el testículo dañado es uno solo.

Patología Clinica
Los análisis de laboratorio usados en el diagnóstico de brucelosis incluyen el aislamiento del microorganismo y pruebas en busca de la presencia de aglutininas contra Brucella abortus en suero sanguíneo, leche, moco vaginal, suero lácteo y plasma seminal.
El aislamiento del microorganismo por cultivo o inoculación al cobayo se efectúa a partir del abomaso o pulmones de fetos abortados o de placenta. Si esto no es posible podemos obtener una muestra de exudado uterino, ya que el microorganismo persiste en el tejido días después del parto. Pueden observarse frotis obtenidos de puntos de fijación de la placenta. Se dispone de pruebas serológicas para la identificación de aglutininas contra Brucella abortus en suero sanguíneo y leche. Se recomienda la prueba de anillo en leche para detectar vacas infectadas.
Hay criterios especificados para el uso de la prueba de aglutinación en tubo, animales con titulo de anticuerpos contra Brucella abortus < a 30 UI serán aceptados mientras que aquellos superiores a 67 UI serán eliminados y los animales ubicados entre éstos títulos se declaran indecisos.

Pruebas complementarias

  • En suero sanguíneo: aglutinación en tubo (lenta), aglutinación en placa( rápida), fijación de complemento, inactivación por calor, aglutinación en placa ácida, mercaptoetanol, rivanol, bloqueo de anticuerpos, fijación en superficie.
  • En leche: anillo, aglutinación en placa leche completa, aglutinación suero en tubo, placa en suero, fijación de complemento en suero.
  • Prueba de aglutinación en moco vaginal o plasma seminal.
  • Cultivo de moco vaginal, semen, heces o producto del feto abortado.

Preparación de los antígenos
Para la práctica de las diversas pruebas de aglutinación y para la prueba de fijación del complemento (FdC) se emplean preparaciones antigénicas en forma de suspensiones de células enteras elaboradas a partir de las cepas lisas 99 o 1119-3 de Brucella abortus. Para las pruebas del anillo lácteo, de rosa de bengala y pruebas de aglutinación en placa tamponada se utilizan preparaciones similares, aunque teñidas respectivamente con hematoxilina, rosa de bengala o verde brillante/violeta cristal.

Para la producción de antígenos de diagnóstico debe usarse la cepa 99 (Weybridge) o la cepa 1119-3 (United States Department of Agriculture, USDA) de B. abortus. Las cepas deben ser completamente lisas y no aglutinables ni en solución salina ni en acriflavina al 0,1% (p/v). Tienen que constituir cultivos puros y ajustarse a las características típicas de las cepas independientes de CO2 del biovar 1 de B. abortus. Para obtener un conjunto de cultivos germinales de partida es preciso cultivar las líneas germinales originales. El lote germinal así obtenido deberá presentar todas las propiedades características de estas cepas, y deberá conservarse después por liofilización o congelación a la temperatura del nitrógeno líquido.
Para proceder a la elaboración del antígeno, debe inocularse un cultivo germinal de las cepas 99 o 1119-3 de B. abortus en una serie de agares inclinados de infusión de patata, que después se incuban a 37°C durante 48 horas. El agar de suero-dextrosa, así como el agar soja-tripticasa (al que puede añadirse suero equino al 5% o extracto de levadura al 0,1%), constituyen medios sólidos satisfactorios, siempre y cuando se utilice un cultivo germinal conforme a las instrucciones expuestas más arriba. Tras comprobar la pureza del cultivo, se resuspende éste en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, pH 6.4, y se siembran capas de agar de infusión de patata o agar de dextrosa-glicerol en frascos de Roux. Después se dejan éstas en incubación a 37°C durante 72 horas, con la superficie inoculada vuelta hacia abajo. Tras comprobar la pureza de los cultivos de los frascos, sometiendo una muestra de cada uno de ellos a tinción Gram, se recogen los organismos. Para ello se añaden a cada recipiente 50-60 ml de solución salina fenolada (0,5% de fenol en solución de cloruro sódico al 0,85%), se agitan suavemente los frascos y se decanta la suspensión. Después se mata a los organismos por calor, manteniéndolos a 95°C durante 1 hora. Previa comprobación de la ausencia de organismos viables, se almacena el antígeno a 4°C.
Un sistema alternativo de producción de antígeno consiste en un cultivo celular, ya sea por lotes o continuo, en un fermentador. Para este cultivo se utiliza un medio líquido con la siguiente composición (por litro de agua destilada): D-glucosa (30 g), una peptona de gran pureza (30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), dihidrógenofosfato sódico (9 g) e hidrógenofosfato bisódico (3,3 g). El pH inicial es de 6.6, aunque tiende a aumentar hasta 7.2-7.4 durante el ciclo de crecimiento. Es necesario cerciorarse de que los lotes de peptona y de extracto de levadura son capaces de inducir un buen crecimiento, sin formación de células anormales o disociadas. Durante la fase de crecimiento se requiere ventilación y agitación vigorosas, y puede ser necesario asimismo ajustar el pH por adición de HCl 0,1 M estéril. El inóculo de células germinales se elabora tal y como ha quedado descrito más arriba. En el caso del cultivo por lotes, éstos deben incubarse a 37°C durante 48 horas. Las series de cultivo continuo pueden prolongarse durante periodos mucho más largos, aunque su mantenimiento exige una mayor habilidad técnica. El cultivo se recoge por centrifugación con el fin de sedimentar los organismos que, a continuación, serán resuspendidos en solución salina fenolada y sometidos a una temperatura de 80°C durante 90 minutos (lo que causará su muerte). Tras comprobar la ausencia de viabilidad del cultivo, se guarda éste a 4°C. En el curso del proceso deberán realizarse comprobaciones periódicas de los cultivos, tanto en medio sólido como en medio líquido, a fin de verificar su pureza, la presencia de un número adecuado de organismos viables y la posibilidad de disociación de las colonias a formas rugosas. Puede determinarse el volumen del concentrado celular de las suspensiones muertas mediante centrifugación de volúmenes de 1 ml en tubos Wintrobe, a 3.000 g durante 75 minutos.

El antígeno para la prueba de FdC (Weybridge) se prepara a partir de un concentrado de organismos muertos de la cepa 99 o 1119-3 de B. abortus, diluyendo dicho concentrado en solución salina fenolada hasta alcanzar una concentración del agregado celular del 2%. Se diluye luego esta suspensión en solución salina fenolada, se titula frente al antisuero estándar internacional contra B. abortus (International Standard anti-B. abortus serum, ISABS) o un suero estándar equivalente, y se ajusta la concentración celular a fin de obtener la sensibilidad adecuada. Tras incubación a 37°C durante 18 horas, debería obtenerse una suspensión estable blanco-grisácea sin agregación o depósitos visibles. El antígeno utilizado en la Unión Europea (UE) debe ser estandarizado frente al ISABS de tal forma que produzca un 50% de fijación frente a una dilución de 1/200 del suero estándar.
Es necesario que la dilución antigénica produzca también una fijación completa a las diluciones inferiores del suero, dado que una concentración de antígeno demasiado débil (o demasiado fuerte) puede no inducir un 100% de fijación a las diluciones inferiores del suero. En el caso de que haya dos diluciones antigénicas apropiadas, se elegirá la suspensión en la que el antígeno esté más concentrado, lo que evitará la aparición de la prozona. Por lo general, y al término del proceso, el antígeno se presenta en forma de concentrado, que antes de su utilización deberá ser disuelto en diluyente de FdC. El antígeno no debe ser congelado.
En la fase de recogida es preciso realizar comprobaciones de la pureza y lisura de las células que van a utilizarse para la preparación de los antígenos de las pruebas del anillo lácteo, de rosa de bengala, de aglutinación en placa tamponada, de aglutinación o de FdC. Una vez muertas, estas células deben formar suspensiones estables en solución salina fisiológica y no manifestar indicios de autoaglutinación. Una vez muertas las células, debe comprobarse también la ausencia de viabilidad de la suspensión: tras 10 días de incubación a 37°C, no deberá observarse signo alguno de crecimiento.

a) Pruebas del antígeno tamponado de Brucella

  • Prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala

El antígeno para la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala se prepara depositando células muertas de la cepa 99 o 1119-3 de B. abortus por centrifugación (por ejemplo, durante 10 minutos a 23.000 g y 4°C), y resuspendiendo después las células de manera homogénea en solución salina fenolada, a razón de 1 g por 22,5 ml. (Nota: si durante la preparación del concentrado celular se ha empleado celulosa carboximetil sódica como agente de sedimentación, será necesario eliminar los residuos insolubles antes de proceder a la tinción. Para ello se filtrará la suspensión con un pre-filtro AMF-CUNO Zeta-plus [tipo CPR 01A].) Por cada 35 ml de esta suspensión se añade 1 ml de rosa de bengala (Cl. No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada. Se deja la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, y a continuación se filtra a través de un algodón. Hecho esto, se centrifuga para depositar las células teñidas, que después se resuspenden de modo homogéneo a razón de 1g de células por 7 ml de diluyente (21,1 g de hidróxido sódico disueltos en 353 ml de solución salina fenolada, más 95 ml de ácido láctico y ajustado a un total de 1.056 ml con solución salina fenolada). Esta suspensión debe ser de un color rosa intenso, y el sobrenadante de una muestra centrifugada debería quedar exento de coloración; el pH debe ser de 3.65±0,05. Después de la filtración a través del algodón, se filtra dos veces más la suspensión a través de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430. A continuación se ajusta el volumen del concentrado celular a un 8%, a falta de proceder a la estandarización final frente a sueros estándar. Se guarda la suspensión a 4°C en la oscuridad. Nunca debe congelarse el antígeno.
Cuando se procede con arreglo al protocolo estándar, el antígeno de la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala debe producir una reacción claramente positiva frente a diluciones 1/45 y 1/47,5 del ISABS (en solución salina), pero no a diluciones de 1/55. También debe ofrecer, ante un determinado panel de sueros, una pauta de reacciones positivas y negativas semejante a la que induce un lote previamente estandarizado.

Protocolo
La prueba de aglutinación en placa o en tarjeta de rosa de bengala constituye un procedimiento adecuado para la realización de cribas (screening) de las muestras de suero. Para la realización de esta prueba se mezcla el suero (0,03 ml) con un volumen igual de antígeno sobre una placa de esmalte o de porcelana blanca. Cada reacción debe ocupar aproximadamente un diámetro de 2 cm. Se agita suavemente la mezcla durante 4 minutos a temperatura ambiente, y después se examina para detectar en ella la presencia de aglutinación (1). Toda reacción visible a simple vista será considerada positiva. Esta prueba es muy sensible, en especial sobre animales vacunados, y deberán confirmarse las muestras positivas mediante la prueba de FdC o una técnica de detección específica de IgG-1. Se producen falsos negativos, que pueden ser detectados mediante nuevos exámenes del animal a intervalos mínimos de 3 meses.

  • Prueba de aglutinación en placa de Brucella tamponado

El antígeno para la realización de esta prueba se prepara a partir de la cepa 1119-3 de B. abortus según el protocolo descrito por Angus y Barton (2).
Se necesitan dos soluciones de tinción: una solución de tinción biológica certificada de verde brillante en agua destilada (2 g/100 ml) y una solución de tinción biológica certificada de violeta cristal en agua destilada (1 g/100 ml). Una vez preparadas, se guardan ambas soluciones por separado durante un periodo de 24 horas, transcurrido el cual se mezclan a volúmenes iguales en un frasco oscuro y se guardan en la nevera, durante un periodo no inferior a 6 meses, antes de su utilización. Puede usarse la mezcla de tinción entre los 6 y los 12 meses posteriores a su preparación. Transcurrido este tiempo deberá desecharse la mezcla.
El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente 150 g de NaOH en 3-4 litros de solución salina fenolada estéril. Se añade ácido láctico (675 ml) a esta solución, y se ajusta el volumen final a 6 litros con solución salina fenolada estéril. El pH de la solución deberá ser de 3.63-3.67.
Se diluye el agregado celular de B. abortus en solución salina fenolada hasta una concentración de 250 g/litro. Se añaden 6 ml de tinción por litro de suspensión celular, y se agita vigorosamente la mezcla antes de filtrarla a través de algodón absorbente estéril. Se hacen sedimentar las células en una centrífuga refrigerada, y después se resuspende el agregado celular en diluyente tamponado (descrito más arriba) hasta una concentración de 50 g/100 ml. Se deja esta mezcla en agitación durante 2 horas, y después se diluye todavía más por adición de 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de suspensión celular (esto es, hasta una concentración final de 50 g de concentrado celular/400 ml de diluyente tamponado). Se remueve la mezcla a temperatura ambiente durante 20-24 horas, antes de ajustar la concentración celular a un 11% (p/v) en diluyente tamponado. Antes de la realización de la prueba es preciso remover esta suspensión durante toda la noche. A falta de las pruebas finales de control de calidad, se embotella el antígeno, se marca en la etiqueta una fecha de caducidad de 1 año y se guarda a 4°C hasta el momento de su utilización. No debe congelarse la preparación.

El pH del antígeno tamponado debe ser de 3.7±0.03, y el pH de una mezcla suero/antígeno de razón 8:3 debe ser de 4.02±0.04. La suspensión al 11% de células teñidas debe tener un color verdeazulado. Debe verificarse cada lote de antígeno, sometiendo a prueba un mínimo de 10 sueros débilmente reactivos y comparando los resultados con los que deparan uno o más lotes anteriores de antígeno. Si es posible, los lotes de antígeno deberán compararse con el antígeno estándar preparado por el NSVL del USDA.

Protocolo
Para una primera criba (screening) de las muestras de suero, éstas pueden ser sometidas también a la prueba de aglutinación en placa tamponada. Se mezcla el suero (0,08 ml) con un volumen de 0,03 ml de antígeno sobre una placa de vidrio dividida en cuadrados de 4 cm de lado. Tras la mezcla inicial, se somete la placa a un movimiento basculante repetido tres veces, a fin de garantizar una dispersión uniforme de los reactivos. Después se incuba la placa en una cámara húmeda a temperatura ambiente (20-25°C) durante 4 minutos. Se retira la placa y se repiten los movimientos descritos anteriormente, después de lo cual se devuelve la placa a la cámara para una segunda incubación de 4 minutos. En este punto debe ser retirada, removida de nuevo y examinada en busca de indicios de aglutinación (1). Toda reacción visible a simple vista será considerada positiva. Al igual que la prueba de aglutinación en placa de rosa de bengala, esta prueba es muy sensible, especialmente en el caso de animales vacunados. Las muestras positivas deben ser verificadas mediante la prueba de FdC o una técnica de detección específica de IgG-1. Se producen falsos negativos, que pueden ser detectados mediante el examen de nuevas muestras del animal extraídas a intervalos mínimos de 3 meses.

b) Prueba de fijación del complejo
La prueba de FdC es el método más extendido para una confirmación del diagnóstico. Existen numerosas variantes de la misma pero, con independencia de la que se elija, deberá usarse en la prueba un antígeno preparado a partir de una cepa lisa autorizada de B. abortus, como la cepa 99 o la 1119-3. El antígeno, además, deberá ser estandarizado frente al segundo ISABS. Es posible preparar el antígeno para la prueba de FdC mediante procedimientos especiales (1, 12), pero también cabe servirse del antígeno empleado para la prueba de aglutinación típica, previa dilución 1/200 (en solución tampón FdC) de la suspensión stock del mismo antes de su estandarización. Antes de su estandarización frente al segundo ISABS (descrita más adelante), el volumen del agregado celular de la suspensión antigénica concentrada para la prueba de FdC debe ser de aproximadamente un 2%. La concentración de fenol no debe exceder el 0,5%. La apariencia del antígeno, una vez llevado a una dilución 1/10 en solución salina fenolada, debe ser el de una suspensión blanca, densa y uniforme, sin agregación o depósito visibles tras una incubación a 37°C durante 18 horas. A la dilución de trabajo utilizada en la prueba no debe producir efectos anticomplementarios. El antígeno no debe ser congelado.
El método de microtitulación constituye un procedimiento adecuado para la realización de esta prueba. Todas las diluciones se realizan en solución tampón preparada a partir de una solución stock de: cloruro de sodio (42,5 g), ácido barbitúrico (2,875 g), dietilbarbiturato de sodio (1,875 g), sulfato de magnesio (1,018 g) y cloruro de calcio (1,147 g) en un litro de agua destilada. Esta solución debe ser diluida antes de su empleo, por adición de cuatro volúmenes de una solución de gelatina al 0,04% (el conjunto constituye el tampón FdC). El sistema revelador es una suspensión de hematíes frescos de oveja al 3%, sensibilizados con un volumen igual de suero de conejo antihematíes de oveja diluido hasta el punto en que contenga el quíntuple de la concentración mínima necesaria para producir un 100% de hemólisis en presencia de una dilución 1/30 de complemento fresco de cobaya. Este último debe ser titulado de manera independiente para determinar la concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis en una suspensión de hematíes de oveja sensibilizados; esta concentración quedará definida como la unidad de complemento. El antígeno estándar de B. abortus para la prueba de aglutinación será diluido en un tampón FdC hasta una concentración tal que arroje un 50% de fijación de complemento (1,25 unidades) ante una dilución 1/200 del segundo ISABS (que puede solicitarse al Laboratorio de Referencia de la OIE para la brucelosis2). Se diluyen los sueros problema en volúmenes iguales de tampón FdC, después de lo cual serán inactivados por calentamiento a 58°C durante 50 minutos.

Protocolo

  • Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos clásicas, se depositan volúmenes de 25 µl de suero problema diluido en los pocillos de la primera y segunda hileras. Además, se depositan unidades de 25 µl de tampón de FdC en todos los pocillos salvo los de la primera hilera.
  • Se practican entonces diluciones seriadas de razón 2, transfiriendo volúmenes de 25 µl de suero de la segunda hilera en adelante.
  • Se añaden a cada pocillo 25 µl de antígeno diluido a la dilución de trabajo, así como 25 µl de complemento con un contenido de 1,25 unidades. Se preparan los pocillos control, que deberán alojar: sólo diluyente; suero + complemento + diluyente; antígeno + complemento + diluyente; y complemento + diluyente. Cada uno de ellos deberá contener un volumen total de 75 µl
  • Se incuban las placas a 37°C durante 30 minutos, con agitación durante los 10 primeros minutos, o bien a 4°C durante toda la noche.
  • Se añaden a cada pocillo volúmenes de 25 µl de hematíes de oveja sensibilizados, y se incuban de nuevo las placas a 37°C durante 30 minutos, con agitación ocasional en el curso de los primeros 10 minutos.
  • Tras dejar reposar las placas a 4°C durante 2-3 horas, a fin de posibilitar la sedimentación de las células no lisadas, se procede a la lectura de los resultados.

Se compara el grado de hemólisis con los estándares correspondientes a un 0, 25, 50, 75 y 100% de lisis celular. Los resultados deben expresarse siempre en Unidades Internacionales de FdC (UI de FdC), calculadas en relación a las que se han obtenido en una titulación paralela con un suero estándar calibrado frente al ISABS. Por lo general, se considerarán positivos los sueros que induzcan fijación completa a un título equivalente o superior a 20 UI de FdC/ml. En las pruebas realizadas sobre animales vacunados pueden aparecer falsas reacciones positivas. Las hembras vacunadas con vacunas de la cepa 19 a la edad de entre 3 y 6 meses serán consideradas positivas si los sueros producen reacción de fijación positiva a un título de 30 UI de FdC/ml, siempre y cuando los animales tengan por lo menos 18 meses de edad en el momento de ser sometidos a prueba. También pueden darse falsos positivos en animales infectados por organismos antigénicamente afines a Brucella. Estos suelen causar muchos menos problemas en la prueba de FdC que en las pruebas de aglutinación descritas en (a).

c) ELISA indirecto
Se han descrito numerosas variantes de esta técnica ELISA indirecta. El mercado ofrece la posibilidad de adquirir diversos ensayos comerciales, pero sólo se recomienda el uso de aquellas pruebas ELISA que utilizan lipopolisacárido (LPS) liso de B. abortus. El espectro de isotipos y subclases de inmunoglobulina bovina detectables por ELISA depende de la especificidad del conjugado anti-inmunoglobulina (o anticuerpo secundario) que se emplee en la prueba. Un ELISA indirecto específico para la detección de anticuerpos contra la IgG1 da resultados que equivalen casi exactamente a los de la prueba de FdC. Esta prueba puede ser utilizada para el estudio de muestras tanto de leche como de suero. La utilización de conjugados específicos tanto para la cadena pesada como para la ligera de la molécula de inmunoglobulina proporciona una sensibilidad de diagnóstico en cierta medida mayor que la prueba de FdC, aunque entraña una cierta pérdida de la especificidad de diagnóstico. Al igual que las demás pruebas convencionales empleadas para el estudio serológico de la brucelosis bovina, el ELISA indirecto no permite distinguir entre anticuerpos resultantes de una infección y anticuerpos inducidos por vacunación con la cepa 19.
Las técnicas ELISA pueden ser usadas como pruebas de criba (screening) o como pruebas de confirmación. No obstante, la eficacia de ELISA en términos de sensibilidad y especificidad de diagnóstico dependerá de la especificidad a la inmunoglobulina que posea el conjugado (véase más arriba), así como del factor de dilución elegido para las muestras problema. El empleo de conjugados de especificidad de amplio espectro, así como el de diluciones bajas, redundará en una prueba de criba de elevada sensibilidad de diagnóstico. Por el contrario, los conjugados de especificidad de espectro reducido (p.e. anti-IgG1), y las diluciones altas del suero problema, resultarán en una prueba de confirmación de especificidad de diagnóstico elevada.

La prueba se lleva a cabo en miniplacas de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano. La elección de la miniplaca tendrá un ligero efecto sobre la eficacia de la prueba, en términos de la actividad de fondo a la que dará lugar. Cuando se utiliza el antígeno LPS, las miniplacas de adherencia proteica entre débil y media proporcionan el nivel más bajo de ruido de fondo.
La solución tampón para el tapizado antigénico es carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9.6, compuesta por: NaHCO3 (2,93 g), Na2CO3 (1,59 g) y NaN3 (0,2 g) en 1 litro de agua destilada o desionizada. El tampón diluyente del conjugado y de los sueros problema es PBS 0,01 M, pH 7.2 + Tween 20 al 0,05% (v/v), que se compone de: Na2HPO4 (1,21 g), KH2PO4 (0,20 g), NaCl (8,00 g) y KCl (0,20 g) en 1 litro de agua destilada o desionizada + 0,5 ml de Tween 20 por litro. La solución tampón de lavado es PBS 0,002 M, pH 7.4, + Tween 20 al 0,05%.
El conjugado empleado debe contener un anticuerpo policlonal específico tanto de la cadena pesada como de la ligera de la IgG1 bovina, marcado con peroxidasa de rábano. El sistema de substrato es H2O2 4,4 mM y ABTS 3,6 mM (ácido 2,2'-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]) en tampón fosfato/citrato 0,05 M, pH 4.5, cuya composición es: Na2HPO4 0,2 M (25,7 ml), ácido cítrico 0,1 M (24,3 ml) y agua destilada/desionizada (50 ml) (ajústese el pH en caso necesario). La solución de parada de la reacción enzimática consiste en dodecilsulfato de sodio al 4% o NaN3 0,1 M en agua destilada/desionizada.

Preparación del antígeno
Puede extraerse LPS liso, mediante el método de agua caliente/fenol caliente, a partir de células de B. abortus muertas por calor. Brucella difiere de la mayoría de las demás bacterias Gram negativas en que, tras la extracción, su LPS queda retenido en la fase de fenol en lugar de la fase hídrica.
Para la extracción se suspenden, en 170 ml de agua destilada, ya sea 5 g de células liofilizadas o bien 50 g de concentrado celular húmedo de la cepa 99 de B. abortus. Se calienta esta suspensión a 66°C. Se añade un volumen igual de fenol al 90% (p/v) en agua destilada, también llevado a 66°C, y se remueve la solución de manera continua durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo, se enfría la mezcla a 4°C y se centrifuga durante 20 minutos a 12.000 g y 4°C. Se deja reposar el sobrenadante (que contiene el LPS) en un embudo separador, a temperatura ambiente durante 24 horas. Se recupera y filtra (Whatman #3) la fase de fenol (capa inferior), y se añaden tres volúmenes de metanol (con metanol al 1% saturado con acetato de sodio). Se deja precipitar la solución a 4°C durante 2 horas. A continuación se resuspende el precipitado en el volumen mínimo necesario de agua destilada, y se centrifuga a 6.000 g durante 20 minutos. Se resuspende el sedimento en 80 ml de agua destilada y se remueve a 4°C durante toda la noche.
A continuación se centrifuga la solución durante 15 minutos a 10.000 g y 4°C, y se decanta el sobrenadante. Se añaden de nuevo 80 ml de agua destilada al sedimento, se remueve durante 1 hora y se centrifuga de nuevo como se ha descrito anteriormente. Se reúnen los sobrenadantes, se filtran (filtro de membrana de 0,3 µm) y se añaden ribonucleasa, desoxirribonucleasa y proteinasa K, a razón de 50-100 µg de cada una. Se incuba la mezcla a 20°C durante 18 horas, después de lo cual se precipita de nuevo con metanol y se resuspende del mismo modo que se ha hecho anteriormente. Se dializa la suspensión frente a agua destilada hasta que quede libre de fenol (lo que se comprueba añadiendo cloruro férrico al agua destilada y esperando a que no aparezca el habitual color morado). El antígeno resultante se liofiliza en volúmenes tales que contengan cantidades de 1 mg de LPS.

Protocolo

  • Se diluye el antígeno LPS en tampón de tapizado hasta una concentración establecida mediante titulación cruzada, por lo general de cerca de 1 µg/ml, y se depositan volúmenes de 100 µl de esta solución en todos los pocillos. Se dejan después las miniplacas en incubación, ya sea a 37°C durante 2 horas o a 4°C durante toda la noche. Dado que se trata de la técnica ELISA en fase sólida, será necesario lavar las miniplacas entre cada uno de los pasos de la prueba, a fin de eliminar el exceso de reactivos que no se hayan fijado o no hayan reaccionado. De tres a cuatro ciclos de lavado con tampón de lavado son suficientes. Antes de la adición del siguiente reactivo, las placas deberán ser volteadas y golpeadas sobre una superficie absorbente, no filamentosa, con objeto de eliminar todo posible residuo.
  • Se llevan los sueros problema y los controles a una dilución de 1/200 en tampón diluyente y se aplican volúmenes de 100 µl de estas soluciones en los pocillos oportunos. Se cubren o sellan las placas y se colocan en un agitador rotatorio. Se incuban a 37°C durante 1 hora en agitación constante. Se lavan las placas como se ha descrito anteriormente.
  • Se diluye el conjugado enzimático en tampón diluyente y se añaden volúmenes de 100 µl del mismo a todos los pocillos. Se cubren o sellan las placas y se colocan en un agitador de placas rotatorio. Se incuban a 37°C durante 1 hora en agitación constante. La dilución óptima de conjugado debe ser aquella que, al reaccionar con el control fuertemente positivo en condiciones estándar, arroje una absorbancia comprendida entre 1,0 y 1,4 unidades de absorbancia (véase el paso vi). Siempre que sea posible deberá usarse el ISABS. Se lavan las placas como se ha descrito anteriormente.
  • Se prepara una solución fresca de substrato-cromógeno, añadiendo 60 µl de una solución stock de H2O2 (al 3%) a 12 ml de tampón fosfato/citrato más ABTS 3,6 mM. Se colocan 100 µl de la solución substrato-cromógeno en cada pocillo. Se transfieren después las placas a un agitador de placas rotatorio y se incuban a 37°C durante exactamente 15 minutos en agitación constante. Tras la incubación de 15 minutos se añaden 100 µl de solución de parada a todos los pocillos, y se agitan brevemente las placas sobre el agitador a fin de garantizar una mezcla completa. Todos los pocillos contienen ahora un volumen total de 200 µl.
  • Se lee la subsiguiente coloración con un fotómetro de miniplacas, utilizando un filtro de interferencia de 405 ó 414 nm.
  • Los datos pueden ser expresados de formas diversas, pero se recomienda expresar la reactividad del suero problema en forma de porcentaje de positividad con respecto a un suero control fuertemente positivo estandarizado (19).

Los sueros control fuertemente positivos deben prepararse de tal manera que, prediluidos en suero negativo, exhiban una actividad de anticuerpos que caiga en el fragmento lineal de la curva dosis/respuesta correspondiente al suero original no diluido, justo debajo de la porción en meseta de dicha curva. Hoy en día se está trabajando en la preparación de un suero estándar primario elaborado según este criterio, con vistas a su utilización internacional para el calibrado de pruebas de ELISA indirecto. Dicho suero debería estar disponible en breve plazo.
Utilizando este protocolo de ELISA indirecto en condiciones de laboratorio óptimas, el valor umbral (o punto final) que discrimina entre resultados positivos y negativos debe situarse entre un 10 y un 15% de positividad. Dentro de este intervalo, la sensibilidad de diagnóstico debería ser igual o superior a la que ofrece la técnica del antígeno tamponado de Brucella en las pruebas realizadas sobre ganado infectado, y la especificidad de diagnóstico debería ser equivalente a la que proporciona el método de FdC en pruebas realizadas sobre ganado no vacunado. Cabe suponer que la especificidad de diagnóstico en el examen de grupos vacunados es en cierta medida inferior a la que ofrece la FdC.
A falta de agua de calidad óptima, o si se modifica cualquiera de los parámetros de la prueba, puede ser necesario elevar el valor umbral para obtener la adecuada eficacia de diagnóstico.

Diagnostico

  • Asegurar le edad del feto mediante inspección y registro de crías.
  • Tomar muestras de sangre para pruebas serológicas con relación a Vibriosis, listeriosis y Leptospirosis.
  • Examinar líquidos uterinos y contenido de abomaso fetal a la primera oportunidad en busca de tricomonas, y subsiguientemente por métodos de cultivo para identificar brucelas, vibriones, Trichomona, listeria y hongos.
  • Completar pruebas mediante cultivos de los pulmones fetales para leptospira y placenta o líquido uterino en busca de bacterias y hongos especialmente si no se dispone de feto.
  • Examinar placenta fijada para formular en su caso diagnóstico de placentitis.
  • En fetos abortados se observan petequias múltiples características en piel, conjuntiva y mucosas, hipertrofia de ganglios linfáticos y afección nodular del hígado.

Control
Se basa en la higiene, vacunación, prueba y eliminación de reactores.
Medidas higiénicas como el aislamiento o eliminación de animales infectados, destrucción de placentas, secreciones uterinas y fetos abortados, desinfección de zonas contaminadas.
Prevención: administración de la vacuna contra la brucelosis cepa 19 o RB51.

4. Campylobacteriosis genital bovina

Aislado por primera vez en 1913 a partir de abortones de vaca y de oveja, el Campylobacter fetus, fue durante mucho tiempo considerado como un agente simple de los abortos en al ganado vacuno. La aplicación de la inseminación artificial y el tratamiento de los toros han contribuido considerablemente a la reducción de ésta afección. Sin embargo, ésta enfermedad es hoy una causa importante de aborto en la oveja. La Vibriosis presenta todos los caracteres de una enfermedad venérea. Es de naturaleza enzoótica y hace su aparición generalmente después del acoplamiento con un macho infectado; la inseminación artificial a partir de un semen contaminado puede contribuir a la diseminación de la enfermedad. E toro constituye un verdadero reservorio natural de Campylobacter fetus, ya que su presencia no produce ningún signo de enfermedad. Las hembras afectadas se inmunizan espontáneamente después de algunos meses, y su poder reproductor vuelve a ser normal. Recientemente se han realizado ensayos con el fin de proteger hembras por medio de vacunación.

Agente Etiológico
Campylobacter fetus, es un bacilo curvo microaerofílico, sin agrupación definida, Gram negativos, con movimiento característico en espiral que se observa en microscopía de campo oscuro o contraste de fases. Difícil de observar en frotis teñidos a campo claro, generalmente móviles, acapsulados y no esporulados.
En el plano patológico pueden considerarse dos variedades de Campylobacter fetus. El Campylobacter fetus serotipo venerealis, el más frecuentemente encontrado; y el Campylobacter fetus serotipo hyointestinalis responsable de abortos esporádicos en bovinos, ovinos y cerdos.
Campylobacter fetus ya sea del tipo venerealis o hyointestinalis producen formas alargadas en los cultivos, sobre medios de verde brillante. Las dos subespecies son catalasa +, Campylobacter fetus ss. venerealis es H2S(-), mientras que el Campylobacter fetus hyointestinalis es H2S condicionado, es decir, que solo dará lugar al desprendimiento de H2S cuando el medio sea adicionado de cistina.

Epidemiologia
Los bóvidos son naturalmente receptivos, pero ésta receptividad varía según el sexo, la edad e incluso según los individuos; las hembras inmaduras resisten generalmente a los intentos de transmisión. En el toro, el Campylobacter fetus vive de forma saprofita en la superficie de la mucosa prepucial, los toros jóvenes son más resistentes a la infección. En la vaca, el Campylobacter fetus presenta un tropismo particular para el aparato genital y especialmente para el útero grávido, en el cual se desarrolla con preferencia a nivel del espacio útero-corial. Es interesante señalar que ciertas cepas semejantes al Campylobacter fetus son fuente de infección para la especie humana y que los trastornos observados consisten en diarreas y abortos.

Vias De Infección
Enfermedad esencialmente venérea, la Vibriosis se transmite del toro a la vaca y recíprocamente con ocasión del coito, pudiendo también transmitirse por medio de la inseminación artificial, cuando se usa un semen contaminado. La transmisión toro a toro puede llevarse a cabo en caso de recogidas sucesivas cuando no se toma la precaución de reservar una vagina artificial para cada toro. La transmisión por contacto entre animales sanos y animales infectados es negada por diversos autores, en éste caso la contaminación se produciría durante el celo y como consecuencia de un posible contacto entre los órganos genitales externos de una hembra infectada y la de una no infectada. Ciertas cepas de Campylobacter pueden provocar una infección ocasional del ganado vacuno por otra vía distinta a la venérea; frecuentemente ésta infección se acompaña de aborto y no de infertilidad. Sin embargo un toro puesto en contacto de una cama previamente contaminada por un toro infectado, tiene un 50% de probabilidades de albergar el microorganismo y propagarlo 1 a 2 meses más tarde.

Localización
En al macho el Campylobacter fetus se localiza a nivel de la mucosa prepucial. En la hembra se encuentra en los distintos segmentos del aparato genital: vagina, cuello y útero. Este alcanza los cuernos uterinos de 12 a 14 días después de la infección y en un 25% de los casos, llega hasta los oviductos. La infección regresa después de 40-60 días para localizarse en el segmento vaginocervical; las secreciones vaginales permanecen virulentas durante 2-4 meses. Sin embargo se puede encontrar Campylobacter fetus en la vagina de vacas gestantes. El microorganismo se encuentra en el feto (líquido abomasal, riñón, hígado), en membranas y líquidos fetales y en los flujos uterovaginales después del aborto.

Patogenia Y Lesiones
Después de una infección provocada por el coito o la inseminación, la mucosa vaginal presenta una inflamación con destilación de exudados, en los que se puede demostrar la presencia de Campylobacter fetus durante los primeros 9 días. El Campylobacter fetus puede comprometer la fertilización y la implantación y ser origen de una mortalidad embrionaria. Las primeras modificaciones histológicas del endometrio son observadas 16-21 días después de una infección experimental.
En el útero grávido el Campylobacter fetus se ubica sobre los cotiledones que se vuelven hemorrágicos y se cubren de placas blanquecinas, grisáceas o amarillentas; la base se engruesa por la presencia de un exudado viscoso, gris amarillento, mientras que los espacios intercotiledonarios están edematosos y recubiertos de depósitos granulosos y grisáceos. El feto no presenta necesariamente lesiones particulares; sin embargo en ciertos casos puede encontrarse un edema gelatinoso subcutáneo y un exudado fibrinohemorrágico más o menos abundante a nivel de las cavidades pleural y pericárdica. En éstas condiciones el hígado puede hipertrofiarse y contener islotes necróticos.

Sintomatología
La repetición de celos y la irregularidad estral en las hembras cubiertas constituyen un claro exponente para sospechar que el macho está infectado. Los dos síntomas dominantes en la infección en la hembra son la infertilidad y los abortos. Los ciclos estrales se repiten con tendencia a la irregularidad o a alargarse; se pueden observar al mismo tiempo síntomas de vaginitis y cervicitis, y también ciertas descargas purulentas.
Después de un periodo de tres a cuatro meses se establece un estado de inmunidad que influirá sobre la posible evolución de la enfermedad en el hato; la fertilidad tiende a volver a la normalidad y los individuos adultos se reestablecen en primer lugar.
El aborto vibriónico sobreviene no importa en qué momento de la gestación, lo más corriente hacia el quinto mes, pero la cantidad de abortos son generalmente escasos, la infección por Campylobacter fetus hyointestinalis se exterioriza generalmente por abortos esporádicos; la fertilidad en éste caso puede ser normal. En caso de aborto precoz el feto puede ser expulsado con todas sus envolturas, mientras que la retención placentaria es frecuente si el accidente se sitúa en las proximidades del final del parto ; frecuentemente ésta es origen de una infección uterina secundaria, nueva causa de infecundidad.

Inmunidad
La curación espontánea del ganado, 3-6 meses después de haber comenzada la infección es considerada como la resultante de una inmunidad adquirida, pero de la cual se desconoce el tiempo de persistencia. Los estudios experimentales realizados han demostrado la presencia de anticuerpos en moco cervical y suero sanguíneo, estando en función de la vía utilizada para obtener la inmunización y el tipo de antígeno empleado. Sin, embargo existe una relación directa entre la intensidad de la actividad uterina y la presencia de anticuerpos en el moco uterino.

Diagnostico
Los síntomas clínicos conducen solamente a una sospecha de la enfermedad; la prueba real de la existencia de ésta depende del laboratorio, y se basa en poner en evidencia, bien el agente infeccioso o bien los anticuerpos que éste ha producido.

Identificación del agente
La campilobacteriosis se diagnostica bacteriológicamene, ya sea por aislamiento de Campylobacter fetus en cultivo o por inmunofluorescencia. El cultivo bacteriológico puede realizarse bien directamente a partir de muestras o bien después del transporte y/o enriquecimiento de las mismas. En caso de que el procesado de las muestras en laboratorio vaya a realizarse en un plazo superior a las 6 horas desde la recogida de las mismas, será indispensable mantenerlas en un medio especial de transporte. Si no se utiliza dicho medio de transporte, las muestras deben ser remitidas al laboratorio en un recipiente opaco y aislado térmicamente (a una temperatura de entre 4 y 30°C).

  • Toma de muestras

En el macho:
Moco o secreciones prepuciales; semen.
El moco prepucial o el esmegma pueden ser obtenidos por raspado (24), succión (con una pipeta de Bartlett) (1) o lavado prepucial (6). También puede obtenerse el esmegma de la vagina artificial, tras recoger el semen mediante el lavado de dicha vagina con 20-30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para realizar el lavado prepucial se introducen 20-30 ml de PBS estéril, pH 7.2, en la bolsa prepucial. Tras practicar sobre ésta un masaje vigoroso durante 15-20 segundos, se recoge el líquido de lavado en un frasco estéril, que inmediatamente se sella y envía al laboratorio.
El semen debe ser recogido en las condiciones de mayor asepsia posible. Para proceder a su recogida se utiliza un tubo estéril, que se sella inmediatamente después. Las muestras de esmegma obtenidas por raspado o succión, así como las muestras de semen, pueden ser diluidas en PBS o sembradas directamente en un medio de cultivo o un medio de enriquecimiento (medios de enriquecimiento y transporte [MET], medio de Stuart o medio SBL). Se sellan las placas que contienen el medio de transporte y se envían al laboratorio de análisis en un recipiente termoaislante (a 4-18°C) y opaco (9).

En la hembra:
Moco vaginal y cervicovaginal.
La toma de muestras puede realizarse con una torunda, o bien por succión (con una pipeta de Bartlett) o lavado de la cavidad vaginal. Para obtener muestras de buena calidad es indispensable utilizar un espéculo estéril, preferiblemente desechable (25).
Previa limpieza de la región vulval, se realiza un lavado de la cavidad vaginal introduciendo 20-30 ml de PBS estéril con una jeringa unida a un catéter estéril. Se succiona y reintroduce el líquido cuatro o cinco veces antes de recogerlo definitivamente en un frasco estéril, que inmediatamente después será sellado y remitido al laboratorio. También puede recogerse el líquido de lavado vaginal mediante un tampón de gasa estéril mantenido en el interior de la vagina durante 5-10 minutos después de la introducción de PBS. Las muestras de moco vaginal obtenidas por succión deben ser diluidas en PBS o sembradas directamente en un medio de cultivo o enriquecimiento.

Fetos abortados, placentas
En caso de aborto, las muestras más adecuadas son, además de la placenta, el contenido estomacal, el hígado y los pulmones del feto. La recogida de muestras deberá realizarse en las condiciones de mayor asepsia posible. Las muestras serán remitidas al laboratorio en un recipiente refrigerado y termoaislado (a 4-8°C).

Procesado de las muestras
A su llegada al laboratorio, las muestras serán sembradas directamente en medio de cultivo o, en caso necesario, sometidas a un tratamiento adicional.

  • Muestras del tracto genital

Dado que el moco vaginal puede ser muy viscoso, es posible que se precise su licuefacción. Para ello se añade un volumen igual de una solución de cisteína (solución acuosa de hidrocloruro de cisteína a una concentración de 0,25 g/100 ml, pH 7.2, esterilizada por filtración a través de una membrana). Transcurridos 15-20 minutos, puede sembrarse el moco diluido y licuado en medio de aislamiento. Cuando el moco no es muy viscoso, es posible sembrarlo directamente o bien disuelto en un volumen igual de PBS, pH 7.2.

  • Fetos abortados, placentas

El contenido del estómago fetal se siembra directamente sobre un medio de cultivo adecuado. Los órganos y trozos de órganos internos se esterilizan a la llama y seguidamente se homogenizan, hecho lo cual se siembra el homogenado en el medio de cultivo.Tras el lavado de las membranas placentales con solución salina normal o PBS a fin de eliminar la mayor parte de la contaminación de superficie, se raspan las vellosidades coriónicas y se transfiere el raspado a medios de cultivo.

  • Medios de enriquecimiento y transporte (MET)
    Existen varios MET disponibles, como el de Clark (Australia), el de Lander (Reino Unido), el medio SBL (Francia) y los medios de Foley y Clark (utilizados en Estados Unidos) (12, 18-20).

• MET australiano
El MET australiano es un medio excelente, aunque su preparación resulta larga y difícil, lo que dificulta su empleo sistemático cuando debe procesarse un gran número de muestras. Contiene suero bovino estéril más 5-fluorouracilo (300 µg/ml), sulfato de polimixina B (100 Unidades Internacionales [UI]/ml), verde brillante (50 µg/ml), ácido nalidíxico (3 µg/ml), y cicloheximida (100 µg/ml). Se distribuye esta mezcla en frascos de 10 ml provistos de un tapón interior de goma y un tapón exterior de rosca metálico. Se colocan los frascos en un baño maría a 100°C. Cuando el medio se ha solidificado, se perfora el tapón de goma con una pipeta y se reemplaza el aire contenido en el frasco por una mezcla de 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 90% de nitrógeno. Es necesario llevar a cabo este paso dentro de un recipiente anaeróbico. Antes de su utilización se guardará el medio así preparado en el refrigerador durante una semana. Su vida media a 4°C es de 3 meses.
Con uso de una jeringa se inyecta en el medio aproximadamente 1 ml de la muestra problema, haciendo pasar la aguja a través del tapón de goma. Se guarda aproximadamente a 18°C y se remite al laboratorio el frasco así inyectado. El tiempo invertido en su transporte no debe exceder las 48 horas.
Cuando el frasco llega al laboratorio, debe ser incubado a 37°C durante 4 días, transcurridos los cuales se introducen en él 3 ml de solución salina normal. Tras vigorosa agitación del frasco, se extrae 1 ml de líquido de su interior, que será sometido a continuación a una prueba de detección de Campylobacter, ya sea mediante su aislamiento en cultivo o por inmunofluorescencia.

• Medio de Lander (Reino Unido)
Este medio es en un caldo de Mueller-Hinton, al que antes de su esterilización se añaden 5 g de carbón bacteriológico/litro. Llegado el momento de su utilización se añaden, en condiciones de esterilidad, los siguientes ingredientes por litro: dos frascos de factor de crecimiento para Campylobacter (Oxoid), sangre de caballo hemolizada (70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.000 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprima ( 20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg ). Se distribuyen volúmenes de 10 ml del medio en contenedores universales de 28 ml, en los que puede permanecer almacenado durante por lo menos 3 semanas a 4°C.
Se inoculan las muestras problema al medio. Previamente, pueden haberse pasado los fragmentos de muestra a través de un filtro de 0,65 µm de diámetro de poro. Tras una incubación de 3 días a 37°C, se distribuye el medio en medios de cultivo y de aislamiento.

• Medio SBL modificado (Francia)
Este medio, descrito por Gastrin (1968) y modificado posteriormente por Clark (5), presenta la siguiente composición por litro: agar (8 g), tioglicolato de sodio (0,5 g), glicerofosfato de sodio (10 g), una solución acuosa de cloruro cálcico al 1% (10 ml), cisteína (hidroclorhidrato) (250 mg) y una solución acuosa de azul de metileno al 0,1% (2 ml). Tras su esterilización por autoclavado, y a fin de transformar el medio en un medio selectivo, se añaden a él los siguientes compuestos por ml: polimixina (1 UI), novobiocina (5 µg), bacitracina (15 unidades) y cicloheximida (20 µg). Finalmente, se distribuye el medio en condiciones de esterilidad en tubos anaeróbicos.
Pueden colocarse en este medio de transporte torundas empapadas en diferentes muestras, y enviar el conjunto al laboratorio dentro de un recipiente termoaislado (a 18-30°C). Este debe llegar a su destino en un plazo de 24-48 horas.

5. Aislamiento de Campylobacter fetus

  • Medios de cultivo para el aislamiento

Actualmente se utilizan numerosos medios para el diagnóstico bacteriológico de la campilobacteriosis genital bovina (3). Siguen algunos ejemplos:

• Medio de Skirrow (medio básico 1)
Se disuelven 40 g de medio básico de agar sangre nº 2 (Oxoid) en 1 litro de agua destilada hirviendo y se distribuye la dilución caliente en botellas previamente esterilizadas en el autoclave (121°C durante 14 minutos). Tras dejar enfriar a 55°C, se añade, en condiciones estériles: sangre de caballo hemolizada (50 ml) y dos frascos de factor de crecimiento (mezcla de Skirrow) (22).

• Agar de corazón-cerebro (medio básico 2)
Se diluyen en 1 litro de agua destilada: infusión de cerebro de ternero (200 g), infusión de corazón de buey (250 g), peptona proteosa (10 g), glucosa (2 g), cloruro de sodio (5 g), hidrogenofosfato disódico anhidro (2,5 g), medio de tiol (3 g) y agar (20 g). Se esteriliza la solución por autoclavado a 121°C durante 15 minutos.
Es posible preparar este medio al instante o con antelación, en cuyo caso puede conservarse a 4°C durante aproximadamente 15 días.

• Agar de corazón-cerebro con sangre
Este medio contiene medio básico 2 (enfriado hasta 63°C tras la esterilización o bien, si se parte del medio frío, calentado durante 30 minutos en el baño maría), más sangre de oveja calentada a 63°C durante 3 minutos (7-10 % en volumen).

• Medio selectivo
Este medio consta de: medio básico 1 ó 2 (100 ml) llevado a 63°C como se ha indicado anteriormente; sangre de oveja (7-10% en volumen); y una de las dos mezclas siguientes:
SEA mezcla inhibidora nº 1, que contiene (concentraciones finales): bacitracina (15 UI/ml), novobiocina (50 µg/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml) y cicloheximida (20 µg/ml).
SEA mezcla inhibidora nº 2, que contiene (concentraciones finales): vancomicina (20 µg/ml), trimetoprima (10 µg/ml), sulfato de polimixina B (5 UI/ml) y cicloheximida (100 µg/ml).
Antes de su adición al medio de cultivo, las soluciones de antibióticos deben ser esterilizadas por filtración.

• Medio selectivo de Clark
Este medio consta de peptona (10 g), cloruro de sodio (5 g), extracto de carne (5 g) y agar (15 g). Se disuelven estos ingredientes, excepto el agar, en 1 litro de agua destilada (con agitación en caso necesario). Se ajusta el pH a 7.4-7.6, hecho lo cual se añade el agar y se lleva la mezcla a ebullición. Se esteriliza por autoclavado (121°C durante 15 minutos). Una vez enfriada la solución a 55°C, se añaden a ésta: en primer lugar un 10% de sangre bovina u ovina desfibrinizada y estéril, y después bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml), novobiocina (sal sódica) (5 µg/ml) y cicloheximida (10 µg/ml).

  • Siembra del medio e incubación.

Se siembra cada muestra, bien directamente o bien previo paso a través de un filtro con un diámetro de poro de 0,65 µm, en una o dos placas de medio básico y una o dos placas de medio selectivo. A continuación se extiende el material con el asa metálica para facilitar el aislamiento de colonias individuales.
Se incuban las placas a 37±1°C en una atmósfera con un 5% de O2, un 8% de CO2 y un 87% de N2 durante 5-7 días. El empleo de una estufa de triple gas con humedad controlada (mínimo 70%) ofrece las condiciones óptimas de cultivo. Cuando no se dispone de ella, es posible utilizar en su lugar un frasco o recipiente similar, introduciendo en él, en condiciones de vacío de 56 mmHg, una mezcla de 10% de CO2 y 90% de N2 hasta obtener una presión máxima de 0,2 bar. Se recomienda, cuando ello sea posible, esterilizar los gases introducidos en la estufa por filtración a través de membrana.
Debe practicarse una comprobación sistemática de las condiciones de cultivo e incubación, mediante la siembra de dos cepas control. Dichos controles deberían ser establecidos para cada uno de los procesos de aislamiento. Sin embargo, es innecesario disponer más de un control por día, salvo si los lotes de medio utilizados son diferentes, en cuyo caso cada lote deberá llevar asociado su propio control.

  • Lectura de los resultados

Las colonias de C. fetus suelen aparecer en los medios recomendados al cabo de 2-5 días. El crecimiento puede ser lento, especialmente en presencia de bacterias contaminantes en las muestras. Transcurridos de 3 a 5 días de incubación, las colonias suelen medir entre 1 y 3 mm de diámetro. Son ligeramente rosadas, de forma circular, convexas, lisas y brillantes, y presentan un reborde regular.

Pruebas de identificación
Para realizar una prueba de identificación correcta es preciso disponer de un cultivo puro. No obstante, y en el supuesto de que existan muchas colonias sospechosas correctamente aisladas, será posible realizar las pruebas directamente sobre las colonias retiradas de las placas de aislamiento. En tal caso, y tras inocular de nuevo las colonias sospechosas a fin de obtener un cultivo puro, deberá repetirse la prueba.
Las pruebas de identificación se basan en los siguientes criterios: aspecto y motilidad, en el caso de organismos vivos; tinción Gram; prueba de la oxidasa; y prueba de la catalasa. Se recomienda utilizar un microscopio de contraste de fases para la observación de las colonias vivas.
C. fetus toma a menudo la forma de un bacilo curvo y fino, de 0,3-0,4 µm de anchura y 0,5-8,0 µm de longitud. No obstante, es posible observar simultáneamente formas cortas (con apariencia de coma), formas de tamaño medio (en forma de ’S’) y formas largas (helicoidales con presencia de espirales). Las bacterias se hallan invariablemente separadas unas de otras.
C. fetus es móvil. Presenta una motilidad típica de tipo anfítrico polar, que desaparece frecuentemente en los subcultivos.

Pruebas de confirmación
Estas pruebas (véase Tabla 1) deben ser realizadas sobre cultivos puros, con empleo, siempre que ello sea posible, de una suspensión estandarizada con un grado de turbidez inferior o equivalente a un McFarland nº 1.

  • Prueba de requerimientos respiratorios

Toda cepa sospechosa debe ser sometida a esta prueba. Para su realización, se prepara una suspensión en una solución tampón, pH 7.2, que se inocula en tres placas de cultivo. Estas son después incubadas en atmósfera normal, o en una atmósfera con un 7 a 10% de CO2 o en una atmósfera que contenga la mezcla triple de gases anteriormente descrita. Se incluyen asimismo en la prueba dos cepas control.
La prueba resulta positiva si se produce crecimiento bacteriano en alguna de las dos (o en ambas) atmósferas provistas de una mezcla gaseosa especial, y si además no hay crecimiento en la atmósfera ordinaria. No obstante, debe tenerse en cuenta que algunas cepas pueden dar lugar a un cultivo muy disperso en atmósfera normal. El crecimiento de C. fetus subespecie venerealis es dependiente de la triple mezcla gaseosa CO2-O2-N2, mientras que el de la subespecie fetus es dependiente de CO2.

Tabla 1. Características diferenciales del género Campylobacter.
Requerimientos respiratorios Metabolismo respiratorio Prueba de crecimiento

CO2-O2- N2 CO2 Oxidasa Catalasa H2S(e) 25°C 42°C Glicina 1% NaCl 3.5%
C. fetus subsp venerealis +(a) (+) 0(b)(+) + + - + - - -
C. fetus subsp fetus - (+) +(c)(+) + + - + - + -
C. jejuni - (+) -(d)(+) + + - - + + -
C. faecalis - (+) - (+) + + ++ - + + ±
C. sputorum subsp bubulus - (+) - (+) + - ++ ± - + +
+(a) = Requiere la mezcla gaseosa; - = Ningún requerimiento; 0(b) = El requerimiento de CO2 no es estricto; (c) Crecimiento difícil para algunas cepas; (d) = El crecimiento de algunas cepas mejora en presencia de CO2; (e) = En medio de agar con triple azúcar y hierro; () = Crecimiento (+)o ausencia de crecimiento (-)de la cepa en un medio apropiado, en las condiciones que se especifican.

  • Prueba de crecimiento en presencia de glicina

Toda cepa sospechosa debe ser sometida a esta prueba. Para ello debe prepararse una suspensión en solución tampón, pH 7.2. Se inocula dicha suspensión en un medio con glicina (15 ml de medio de sangre + exactamente 1,65 ml de solución acuosa de glicina al 10%) y en un medio de sangre básico. Se incuban los cultivos en las condiciones de atmósfera especificadas e incluyendo en paralelo dos cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Dado que todas las cepas son exigentes, la introducción de cualquier cambio en los medios, por pequeño que sea, puede condicionar el crecimiento. La falta de crecimiento en el medio con glicina debe ser considerada un indicio presuntivo de la presencia de C. fetus subespecie venerealis.

  • Prueba de crecimiento en presencia de cloruro de sodio

Se prepara una suspensión de la cepa sospechosa en solución tampón, pH 7.2. Después se inocula dicha suspensión en un medio de sangre provisto de un 3,5% de NaCl (15 ml de medio de sangre + 2,04 ml de NaCl 5 M) y en un medio de sangre. Se incuban los cultivos en las condiciones de amósfera especificadas. La prueba debe incluir asimismo dos cepas control.

  • Prueba de producción de sulfuro de hidrógeno

La prueba del sulfuro de hidrógeno (H2S) se efectúa en un medio de agar con triple azúcar y hierro (triple sugar iron, TSI) cuya composición es la siguiente: peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro de sodio (5 g/litro), citrato férrico (0,5 g/litro), tiosulfato de sodio (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro), sucrosa (10 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo de fenol (0,024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada (con la que se ajusta a 1 litro). Previa mezcla, y tras repartir el medio en tubos, se esterilizan éstos por autoclavado a 115°C durante 15 minutos. Es posible preparar el medio en el momento de su utilización o con antelación, en cuyo caso puede ser conservado en las condiciones habituales durante aproximadamente 3 semanas.
Antes de su empleo, deberá fundirse el medio en un baño maría hirviendo e inclinar los tubos, de tal manera que se obtenga una pendiente con 3 cm de profundidad. Este medio, listo para usar, podrá ser conservado en las condiciones habituales durante 8-10 días antes de su utilización.

  • Prueba de sensibilidad al trifeniltetrazolio, a la cefalotina y al ácido nalidíxico.

Para medir la sensibilidad al trifeniltetrazolio (TTC), a la cefalotina (CN) y al ácido nalidíxico (NA) se emplea la técnica del disco (23). Esta técnica consiste en empapar discos de papel de filtro en soluciones de TTC (30 mg/ml), CN (3 mg/ml) y NA (3 mg/ml), de tal manera que el contenido final de los discos sea respectivamente de 200 µg de TTC, 30 µg de CN y 30 µg de NA. A continuación se secan y almacenan los discos hasta el momento de su utilización.
Para llevar a cabo la prueba se realiza una suspensión en PBS, pH 7.2, de células procedentes de cultivos de 72 horas de las cepas a examinar, a una concentración de 109 bacterias/ml. A continuación se toman volúmenes de 100 µl de dicha suspensión y se reparten éstos homogéneamente sobre un medio de sangre básico. Tras secado de las placas se deposita el medio de cultivo sobre su superficie y, por último, los discos de sensibilidad sobre éste. Se incuban después los cultivos a 37°C en una atmósfera apropiada. Los cultivos deberán ser examinados al cabo de sendos periodos de 48 y 96 horas. La presencia de una zona de inhibición de por lo menos 3 mm alrededor del disco indica sensibilidad de la cepa en cuestión al antibiótico. C. fetus subespecie venerealis, venerealis intermedius y fetus son sensibles al TTC y a la CN.
Para una correcta identificación bacteriológica deben cumplirse los siguientes requisitos: ausencia de contaminación en las placas de cultivo; crecimiento satisfactorio de las cepas control desde el segundo día de incubación hasta el momento de la observación; obtención de resultados similares a los esperados en las pruebas realizadas sobre las cepas control.
Un resultado negativo no será concluyente hasta transcurridos por lo menos 6 días de incubación en las condiciones requeridas.

Se considerará perteneciente a la especie C. fetus cualquier bacteria que presente las siguientes características:
• Aspecto característico de las colonias sobre los medios de cultivo descritos anteriormente;
• ausencia de crecimiento detectable a simple vista al cabo de 24 horas;
• crecimiento lento (2-3 días) a 37±1°C en atmósfera especial (a una tensión de oxígeno reducida);
• morfología característica de una bacteria espiral;
• motilidad de tipo anfítrico;
• Gram negativa;
• oxidasa positiva;
• catalasa positiva;
• requerimientos respiratorios y propiedades bioquímicas característicos.

Inmunofluorescencia
Esta prueba puede ser utilizada para identificar el organismo mediante la técnica directa o para confirmar la identificación de una cepa después de su aislamiento. No permite, en cambio, discriminar entre diferentes subespecies (22).

  • Preparación de los sueros inmunes

Es preferible emplear cepas estándar de Campylobacter, procedentes de colecciones de cultivos reconocidas (C. fetus subespecie venerealis biotipo venerealis, C. fetus subespecie venerealis biotipo intermedius o C. fetus subespecie fetus). Se cultivan dichas cepas por separado, en atmósfera microaeróbica y en un medio de agar sangre, a 37°C durante 3 días. Pasado este tiempo, se recogen los microorganismos en PBS, pH 7.2, y se lavan dos veces por centrifugación. Después se inoculan conejos de 3 meses, por vía intramuscular, con 2 ml de una solución de 1011 bacterias/ml de una subespecie de C. fetus, previamente resuspendida en PBS más adyuvante incompleto de Freund. La inoculación se practica en cuatro sitios distintos, a razón de 0,5 ml por punto de inyección. Los animales deben ser sangrados antes de la inoculación, y a intervalos semanales después de la misma. Cuando los títulos séricos alcanzan valores elevados, estimados mediante la prueba de inmunofluorescencia o la de aglutinación, se inyectan a los conejos por vía intravenosa entre 0,1 y 1 ml de organismos viables (a razón de 1010 organismos/ml). 7 días más tarde se sangra a los conejos y se mezclan todos los sueros homólogos.

  • Preparación de conjugados

La fracción de IgG se aísla por precipitación con sulfato sódico. Para ello, se ajusta el pH del suero a 8.0 con PBS 0,1 M, y se añaden 18 g de sulfato sódico anhidro por cada 100 ml. Se recoge el precipitado por centrifugación, y se resuspende en agua destilada hasta su volumen original. Después se precipita de nuevo, por adición de 12 g de sulfato sódico/100 ml. Se recoge el precipitado, se redisuelve en agua destilada, esta vez hasta la mitad del volumen original, y se dializa a 4°C frente a PBS, pH 7.2, hasta que todo el sulfato sódico haya sido eliminado. Hecho esto, se determina el contenido proteico y se ajusta la concentración de la solución para que contenga 1,0-1,5 g de proteína (albúmina sérica bovina) por 100 ml de PBS. Se ajusta el pH de esta solución a 9.0 con carbonato sódico 1 M. A continuación se añade el isómero 1 del isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate, FITC) disuelto en un volumen mínimo de carbonato sódico 0,1 M, en una cantidad tal que proporcione una concentración final de 15 mg FITC/1,0 g proteína. Se remueve a 4°C durante 18 horas, transcurridas las cuales se ajusta el pH a 7.0 con ácido clorhídrico 0,1 M y se dializa a 4°C con cambios frecuentes de PBS. Se eliminan las trazas de FITC libre por filtración en gel (en Sephadex G25), y se guarda el producto final en pequeñas alícuotas a una temperatura igual o inferior a -20°C.

La dilución de trabajo del conjugado se determina sometiendo a prueba diversas diluciones del mismo en PBS frente a frotis de un cultivo de C. fetus; deberá seleccionarse el doble de la concentración más baja que llegue a producir una fluorescencia brillante de estos organismos. Vistos a gran aumento, los organismos adoptan un patrón de fluorescencia de morfología característica, y se localizan frecuentemente en los bordes del frotis.

  • Prueba de inmunofluorescencia

Se fijan las muestras sobre portaobjetos de vidrio, se colorean con el antisuero marcado con FITC y se observan al microscopio en busca de organismos fluorescentes. La reacción de coloración se lleva a cabo en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos. Después se aclaran los portaobjetos lavándolos dos veces en PBS durante 10 minutos a fin de eliminar el exceso de conjugado. Hecho esto, se montan en glicerol tamponado (80% [v/v] glicerol + 20% tampón fosfato 0,1 M, pH 8.0).
Por último, se sellan los cubreobjetos para evitar la desecación y se observan las preparaciones al microscopio bajo luz ultravioleta.

6. Listeriosis

Se trata de una enfermedad común al hombre y a distintos animales domésticos especialmente a los rumiantes, en los que produce abortos más bien de forma esporádica que epidémica. La oveja es más sensible que la vaca y la cabra.

Etiologia
Agente patógeno la Listeria monocytogenes es un germen Gram (+), aerobio), hemolítico y catalasa positivo. Ampliamente distribuido en la naturaleza en forma saprofita ; en el animal infectado se distribuye irregularmente, encontrándose en el SNC, lesiones necróticas de hígado y miocardio, en los abortos y envolturas fetales.
La infección se establece a través de diferentes vías, especialmente por la mucosa nasal y ocular, y sobre todo a través del tubo digestivo cuando consumen alimentos contaminados. A ese respecto los forrajes mal conservados, ricos en ácido butírico, y en amoniaco, constituyen un medio favorable para la multiplicación de éste agente y para su diseminación. Se ha señalado la presencia de listerias en esperma de ovinos y caprinos, sabiéndose que las vacas enfermas pueden excretar éste germen por la leche durante varios meses.

Lesiones
Se observan focos necróticos en el hígado y en la placenta, que puede estar cubierta de un exudado abundante, rojo marrón, particularmente en la oveja; infiltración leucocitaria a nivel de estos focos necróticos.

Síntomas
Además de transtornos de naturaleza septicémica y encefalítica tales como actitudes anormales, desequilibrio, torneo, caída de orejas y parálisis del labio inferior, hay que resaltar el aborto que se produce en los últimos días de la gestación. En caso de parto normal el recién nacido puede morir en las primeras semanas de vida. El aborto puede ir acompañado de retención de envolturas fetales y también de metritis.

Diagnostico
Por el cuadro clínico de la enfermedad puede ser sospechada pero no confirmada. El diagnóstico requiere el aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de muestras de líquido estomacal, de envolturas fetales, hígado, sistema nervioso o de los exudados de las cavidades. Corrientemente el examen bacterioscópico resulta negativo y es necesario recurrir a los cultivos o a las inoculaciones en animales de laboratorio. Las pruebas serológicas tienen un valor muy limitado.

7. Tuberculosis bovina

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por bacterias del genero Mycobacterium, las cuales presentan como rasgo característico el ser inmóviles, no esporulados y ácido-alcohol resistencia.
Esta enfermedad ha sido erradicada de los países desarrollados. En otros países en donde la enfermedad clásica se ha reducido, la enfermedad es producida por micobacterias atípicas. Los niveles de infección de tuberculosis bovina en el rodeo nacional se estima entre un 3% a 4%.

Etiología
Las micobacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, incluyendo desde saprofitas, patógenas, oportunistas y estrictamente patógenas.
Los bacilos tuberculosos clásicos son:
M. tuberculosis (Hombre)
M. bovis (Bovinos)
M. avium (Aves)

También se incluye en este grupo el Mycobacterium microti, el cual a diferencia de los anteriores no afecta humanos, pero produce tuberculosis en las ratas.

Transmisión
Del 80% al 90% de los casos la transmisión ocurre por vía aerógena; con la tos o espiración de un animal infectado se expelen gran cantidad de microgotitas que contienen la bacteria las cuales al ser inhaladas por otro bovino llegan al sistema respiratorio dando comienzo a una nueva infección. Esto se ve favorecido por contacto directo diariamente de los bovinos en el pastoreo, comederos, corrales y salas de ordeño.
Otra vía de ingreso es la digestiva por el consumo de pastos y alimentos contaminados con secreciones nasales, materia fecal y orina que contienen el agente causal.
La vía digestiva es muy importante en terneros que se alimentan con leche cruda proveniente de las vacas enfermas, debido a que del 1% al 2% de las vacas infectadas eliminan el microorganismo en la leche. Otras vías no usuales pero probables son: la vía cutánea, congénita y genital.

Patogenia
Factores de manejo, edad y nutrición son determinantes en la vía de infección, así como en el periodo de incubación, proceso de la enfermedad y diseminación.
A partir de la puerta de entrada los bacilos se localizan en el complejo primario de los ganglios linfáticos regionales, luego se diseminan por vía linfática a la cadena ganglionar. Posteriormente la diseminación se da por vía hematógena a órganos parenquimatosos por ultimo el microorganismo es eliminado en exudados y secreciones de órganos infectados.
La eliminación de Mycobacterium bovis por parte de los animales infectados es intermitente y no esta en relación con el grado de infección presente. Se ha comprobado que los animales infectados recientemente eliminan el microorganismo en las etapas tempranas de la enfermedad cuando a veces no son detectadas por pruebas diagnosticas.

Síntomas
Los síntomas son poco manifiestos en el bovino, pero en algunos puede presentarse. La vía de ingreso del M. bovis y la localización de la lesión están íntimamente relacionadas en esta enfermedad.
Las lesiones pueden localizarse en diferentes órganos y ganglios linfáticos, en forma de nódulos o tubérculos de material purulento-caseoso de color amarillento cuyo tamaño y cantidad varían.

Diagnostico
El diagnostico de la tuberculosos en hatos primo-infectados se hace por la caracterización macro y microscópica de las lesiones en animales muertos en la finca o remitidos al matadero, seguido del aislamiento y tipificación en el laboratorio.
En las áreas endémicas el diagnostico se hace antes de que muera el animal por dermoreacción, además debe hacerse vigilancia en los mataderos y hacer evaluación macro y microscópica de las lesiones compatibles con tuberculosis.

Lesiones
Macroscopicas:
Las lesiones pueden variar dependiendo de la localización anatómica y la forma de diseminación.
Generalmente el hallazgo pulmonar es áreas de tamaño considerable con apariencia caseificada y zonas de mineralización.
En las superficies serosas incluyendo las cápsulas de los órganos se observan nódulos firmes de superficie lisa, varían de 2 a 10 centímetros de diámetro. También pueden presentarse zonas caseificadas en las áreas profundas (Tuberculosis perlada).
Nódulos firmes de aspecto granulomatoso con áreas de calcificación y caseificación en ganglios linfáticos y órganos parenquimatosos como el hígado y el riñón.
Exudado de apariencia purulenta en meninges
Focos muy pequeños menores de 1cm de diámetro en cualquier órgano (Tuberculosis miliar).
Microscópicas
En cualquiera de las formas en que se presenta la tuberculosis, esta se caracteriza por la formación de granulomas.
Se pueden detectar bacilos ácido alcohol resistentes libres en el citoplasma de los macrófagos, histiocitos y células gigantes de la lesión granulomatosa.

Dermorreaccion
El método clásico para la detección de la tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina.

Prueba Tuberculinica Cervical Simple
En esta prueba el lugar de inoculación es el tercio medio del cuello. Esta zona se debe depilar con maquina o tijera a 5 cm. de diámetro aproximadamente. Se mide con un calibre el espesor de la piel previamente y se inyectan 0.1 ml de tuberculina PPD bovina de un miligramo por mililitro.
La lectura se hace mediante un calibre a las 72 horas (más o menos 6 horas). Cuando la lectura se ve impedida por razones climáticas u otras causas, esta puede hacerse hasta 24 horas mas tarde. Si la lectura se realiza mas tarde de esto la prueba no tiene validez por lo que el diagnostico no será confiable y debe repetirse la prueba a los 60 días.
Positivo: 3mm o mayor
Negativo: menos de 3mm

Prueba Tuberculinica Ano-Caudal
Esta prueba se realiza en el pliegue ano-caudal interno a unos 6 cm. de la base de la cola y en el centro del pliegue. Esta zona es menos sensible a la tuberculina que la piel del cuello. Se inyectan 0.1 ml de PPD bovina de un miligramo por mililitro.
La lectura se hace mediante un calibre a las 72 horas (más o menos 6 horas).
Positivo: 5mm o mayor.
Sospechoso: 3mm/ mas o menos de 5mm.
Negativo: menos de 3mm.
Hay que tener en cuenta que todo animal sospechoso en un establecimiento donde se hayan detectado animales reaccionantes positivos en pruebas anteriores o en la que se esta realizando se le debe considerar positivo.

Prueba tuberculinica comparativa
La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la realización de un diagnostico diferencial entre animales infectados por Mycobacterium bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras micobacterias. Este tipo de sensibilización puede ser atribuido a la gran reactividad antigénica cruzada existente entre las especies de micobacterias y otros géneros afines.
Esta prueba consiste en la inyección de tuberculina bovina y tuberculina aviar en diferentes puntos del cuello y en la subsiguiente evaluación de la respuesta transcurridos 3 días.
Para esta prueba comparativa la dosis de tuberculina no debe ser inferior a 2.000 UI de tuberculina bovina ni a 2.00 UI de tuberculina aviar. La distancia entre ambas inyecciones debe ser de aproximadamente 12 a 15 cm.
Positivo: 4mm mayor que la tuberculina aviar
Dudoso: entre 1 y 4mm mayor que la tuberculina aviar
Negativo: cuando no hay reacción o cuando la reacción es igual o menor que la tuberculina aviar.
En todas la inyección se realiza introduciendo la aguja oblicuamente en las capas profundas de la piel e inyectando la dosis de tuberculina. Después se comprueba que la inyección ha sido bien realizada detectándose al tacto una pequeña inflamación en el lugar de la misma.

Aislamiento
Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes, no formadores de esporas y no encapsulados, por lo que en la coloración de Zielh-Neelsen se observan como bacilos rojo brillante sobre un fondo azul.
Estos microorganismos son aerobios obligados que crecen en medios sintéticos simples, pero para el aislamiento primario a partir de muestras clínicas se requiere de un medio más complejo con una base de papa y huevo como el medio Löwestein-Jensen, o con una base de agar y suero como el medio Middlebrook.
El cultivo se hace a 37º C con una atmósfera de 5-10 % de CO2, el crecimiento es lento y dura de 3 a 6 semanas en desarrollarse, las colonias son pequeñas, secas y con aspecto escamoso.

Control Y Erradicación
Detección y eliminación de todos los animales infectados, control del movimiento de estos, vigilancia en mataderos y dermoreacción, y campañas de divulgación.

Prueba de la tuberculina
El método clásico para la detección de la tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina, que requiere la inyección intradérmica de tuberculina bovina y ulterior detección, transcurridos 3 días, de una inflamación en el punto de inyección.
La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la realización de un diagnóstico diferencial entre animales infectados por Mycobacterium bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras micobacterias. Este tipo de sensibilización puede ser atribuido a la gran reactividad antigénica cruzada existente entre las especies de micobacterias y otros géneros afines. Esta prueba consiste en la inyección de tuberculina bovina y tuberculina aviar en diferentes puntos del cuello, y en la subsiguiente evaluación de la respuesta transcurridos 3 días.
La prueba de la tuberculina se aplica normalmente en la región de la tabla del cuello, aunque en circunstancias especiales puede realizarse en el pliegue caudal de la cola. La piel del cuello, no obstante, es más sensible a la tuberculina que la del pliegue caudal. Para compensar esta diferencia pueden inyectarse dosis superiores de tuberculina en esta última zona.
Tradicionalmente se ha venido usando una tuberculina preparada en un medio sintético y concentrada por calor (Heat-concentrated synthetic medium, HCSM) aunque, en muchos países, ésta ha sido substituida por un derivado proteico purificado (Purified Protein Derivative, PPD). Siempre que su actividad biológica haya sido estandarizada correctamente, la tuberculina HCSM ofrece una potencia adecuada, pero su especificidad es inferior a la de la tuberculina PPD. Por otra parte, ha quedado demostrado que los PPDs bovinos preparados a partir de la cepa de producción AN5 de M. bovis son más específicos que los PPDs humanos elaborados a partir de M. tuberculosis.
La potencia de las tuberculinas debe ser estimada por métodos biológicos, basados en su comparación con tuberculinas estándar. La potencia se expresa en UI. En varios países, y en lo que concierne al ganado vacuno, se considera aceptable una tuberculina bovina cuando su potencia estimada garantiza una dosis mínima por bovino de 2.000 UI (±25%). En el caso de sujetos con una sensibilidad alérgica reducida, será necesaria una dosis superior de tuberculina. Para la práctica de campañas de erradicación se recomiendan dosis de hasta 5.000 UI. El volumen de cada dosis inyectada no debe sobrepasar los 0,2 ml.
Para la prueba intradérmica comparativa, la dosis de tuberculina inyectada no debe ser inferior a 2.000 UI de tuberculina bovina ni a 2.000 UI de tuberculina aviar. La distancia entre ambas inyecciones debe ser de aproximadamente 12 a 15 cm. En animales jóvenes, cuyo cuello tal vez no ofrezca espacio suficiente para cumplir con este requisito, deberá administrarse de forma simétrica una inyección en cada lado, en el centro del tercio medio del cuello.
La utilización de una técnica de inyección correcta es de gran importancia. Las zonas de inyección deben ser afeitadas y limpiadas cuidadosamente. Se mide, con un calibrador de precisión, el espesor del pliegue de la piel en cada área afeitada. Debe emplearse una aguja corta con la punta biselada conectada a una jeringa graduada (que contiene la tuberculina). La inyección se realiza introduciendo la aguja oblicuamente en las capas profundas de la piel e inyectando a continuación la dosis de tuberculina. Después se comprueba que la inyección ha sido bien realizada, en cuyo caso podrá detectarse al tacto una pequeña inflamación en el lugar de la misma. Transcurridas 72 horas, vuelve a medirse el espesor del pliegue de piel en cada punto de inyección.

La interpretación de los resultados se basa en la observación de un aumento del espesor del pliegue cutáneo. En el caso de la prueba intradérmica simple (que requiere una única inyección de tuberculina bovina), la respuesta se considera negativa cuando no se observa más que una leve inflamación, con un incremento de espesor no superior a 2 mm y sin signos clínicos como la presencia de un edema difuso o generalizado, exudación, necrosis, dolor o inflamación de los conductos linfáticos de esta zona o de los ganglios linfáticos. El resultado será considerado dudoso cuando no se observe ninguno de estos signos clínicos y el aumento de espesor del pliegue cutáneo esté comprendido entre 2 y 4 mm. La reacción se considera positiva si se observan los mencionados signos clínicos o si se produce un engrosamiento del pliegue cutáneo igual o superior a 4 mm. Por otra parte, y en el caso de rebaños infectados por M. bovis, cualquier inflamación palpable o visible deberá ser considerada como sinónimo de resultado positivo.
En cuanto a la interpretación de la prueba intradérmica comparativa, suele definirse el resultado positivo como una reacción positiva a la tuberculina bovina y un engrosamiento provocado por ésta superior en 4 mm al que produce la tuberculina aviar. El resultado se considera dudoso si la reacción a la tuberculina bovina es positiva pero el aumento de espesor es entre 1 y 4 mm superior al de la reacción aviar. La prueba será considerada negativa cuando la reacción a la tuberculina bovina sea negativa o, aún siendo positiva, el engrosamiento sea igual o menor que el provocado por una reacción positiva a la tuberculina aviar. El modelo de interpretación aquí descrito es utilizado en los países de la Unión Europea (UE), y su uso viene recomendado en la Directiva del Consejo Europeo 64/432/EEC (4). En ocasiones se adopta una interpretación más restrictiva. En el caso de la prueba de inyección en el pliegue caudal, todo cambio palpable o visible será considerado como reacción positiva.

8. Enfermedades originadas por hongos que pueden causar abortos

Hongos:
Aspergilosis: Aspergillus spp (afecta todas las especies).
Mucormicosis: Rhizophus, Absidia, Mucor ( Afectan todas las especies).
Candidiasis: Candida albicans (equinos).

9. Aspergilosis

Causada por el Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y otras especies de Aspergillus, es una enfermedad que afecta principalmente a los tejidos respiratorios, caracterizada por lesiones inflamatorias granulomatosas, pudiendo ocurrir diseminación hematógena a otros órganos; en ocasiones pueden ser afectados el ojo, la piel, las meninges y el tracto reproductor; la enfermedad es relativamente rara en animales domésticos y en los animales de compañía, pero ocurre con frecuencia en las aves de corral.

Prevalencia
Es generalmente aceptado que el Aspergillus fumigatus es el miembro patógeno más importante del género, también es importante el Aspergillus flavus en las aves en cautiverio. Otras diversas especies de Aspergillus tienen potencial patogénico y en ocasiones han sido consideradas como agentes causales de enfermedad. En los últimos años los informes sobre Aspergilosis en los animales domésticos y en los animales de compañía han aparecido sólo en forma esporádica.
Aunque la Aspergilosis equina fue descubierta por primera vez hace cerca de 100 años, la enfermedad aparentemente es muy rara en caballos, la mayoría de los primeros casos observados se referían a afecciones locales de las aberturas nasales. El Aspergillus fumigatus ha estado asociado con diarreas persistentes en los potros y abortos en bovinos. Los abortos equinos pueden ocasionalmente ser causados por el Aspergillus spp. La Aspergilosis ovina ocurre con poca frecuencia lo mismo que en porcinos, en aves es muy común.

Epidemiologia

El Género Aspergillus es de distribución mundial y tiene un papel muy importante en procesos de descomposición en el suelo. Su ciclo normal de vida es saprofito y no depende del parasitismo de los animales y el hombre para sobrevivir, prolíficos productores de esporas bajo un amplio rango de condiciones ambientales, la diseminación por el aire de sus esporas contribuye a su ubicuidad y a su papel de contaminantes comunes de los laboratorios. Aquellas especies que han sido identificadas como patógenos potenciales con facilidad pueden ser aisladas de aire, polvo, heno y paja; su patogenicidad se fortalece al tomar una acción combinada con antibióticos antibacterianos o esteroides adrenocorticoides, es decir que la administración de una de éstas sustancias puede volver a los animales altamente susceptibles a la Aspergilosis fatal.

Signos Clínicos Y Patología
Los signos clínicos que han sido descritos en animales domésticos y mascotas no difieren materialmente de las neumonías producidas por otras causas. La temperatura elevada, descargas nasales mucopurulentas, conjuntivitis y tos o estornudo son más o menos, manifestaciones constantes. Los abortos micóticos bovinos en general ocurren del tercer al octavo mes de la gestación, el feto abortado rara vez está vivo, la placenta es retenida en aproximadamente el 60 % de los casos.
Macroscópicamente, las lesiones placentarias del aborto micótico bovino debidas a Aspergillus fumigatus, muestran cotiledones de color amarillo a gris, los que están notablemente engrosados, en especial en la periferia. En algunos casos el tejido intercotiledonal aparece con aspecto de cuero y tiene un color gris que varía a moreno. El número de los cotiledones afectados es variable. Como característica se observa una placentitis necrosante con los cambios más severos en los cotiledones. Puede ocurrir extensa necrosis con infiltración polimorfo nuclear alrededor de las áreas necróticas y distribución difusa alrededor de la placenta; el edema y la hemorragia son comunes y extensas; la arteritis generalmente está presente y pueden ser observadas las hifas invadiendo las paredes de los vasos sanguíneos.
Algunos fetos abortados aparecen normales a la inspección. Los que aparecen más afectados, generalmente muestran lesiones circunscritas, elevadas, grisáceas, semejantes a la "tiña".

Diagnostico De Laboratorio
Los Aspergillus constituyen los hongos contaminantes más comunes en el laboratorio y rutinariamente pueden ser cultivados de la piel y del tracto respiratorio superior de los animales sanos; es evidencia presuntiva de Aspergilosis el aislamiento repetido de una especie del Aspergillus del material clínico en ausencia de otros agentes patógenos; la recuperación del microorganismo de tejidos flameados o no expuestos ayuda a soportar el diagnóstico. Otra evidencia se obtiene por la demostración en el tejido de micelio semejante al del Aspergillus spp y el diagnóstico se realiza a veces sobre ésta base. Una combinación de evidencias de cultivo e histológicas es la base más firme para el diagnóstico.

Examen microscópico directo
Las reparaciones húmedas pueden observarse directamente. El material para raspados se obtiene con facilidad de las vías aéreas durante la necropsia de los animales afectados. Los frotis pueden ser teñidos con Gram. El micelio mide 4-6 μ de ancho, es tabicado y de un diámetro regularmente uniforme.

Cultivo
El Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus, así como otras especies de Aspergillus crecen fácilmente en el agar glucosa de saboraud. Los antibióticos antibacterianos pueden ser utilizados en el medio, pero no deberá ser empleada la cicloheximida ya que la mayor parte de Aspergillus son sensibles a éste antibiótico.
Las colonias de Aspergillus fumigatus crecen rápidamente y son planas. Al principio son blancas y ligeramente vellosas, pero conforme se desarrollan las conidias toman un color verde azulado oscuro y un aspecto pulverulento. Los cultivos viejos tienen una apariencia gris "ahumada", muy característica.

Pruebas de patogenicidad
No es necesaria la inoculación animal para la identificación de agentes de la Aspergilosis.

Inmunología
No se han desarrollado pruebas inmunológicas para el diagnóstico de la Aspergilosis en los animales.

Diagnostico Diferencial
Clínicamente, la Aspergilosis de las mascotas y de los grandes animales domésticos necesita ser diferenciada de otras micosis y de infecciones respiratorias de etiología viral. El aborto micótico bovino puede ser parecido al de la brucelosis, Vibriosis y Leptospirosis.

Tratamiento
No existe un tratamiento efectivo contra la Aspergilosis. El control de la enfermedad requiere de la localización de la fuente del hongo esporulante (generalmente la cama) y la eliminación, lo más posible de aquella.

10. Mucormicosis

Es una enfermedad granulomatosa que afecta a diversos animales y al hombre, causada por hongos del género Phycomycetes. Los miembros de la familia Mucoraceae pertenecen a ésta clase y la Mucormicosis comprende la enfermedad, en ocasiones denominada ficomicosis, causada por Mucor pusillus. Se cono ce de una multitud de casos de enfermedades mucormicoticas de los bovinos; En 1935, Jungherr atribuyó a hongos de los géneros Mucor y Rhizopus ser la causa de abortos y otros desórdenes reproductivos. Las lesiones micóticas fueron descritas en una gran variedad de órganos, las más comunes en placentitis micótica y/o neumonía aguda micótica.

Signos Clinicos Y Patología
Adecuadas descripciones clínicas de las Mucormicosis animales sólo han sido registradas para los equinos, en las otras especies animales el diagnóstico se ha realizado por lo común en la necropsia, encontrándose las lesiones en una gran diversidad de órganos.
En los equinos se observa como un área o áreas de granulación exuberante (frecuentemente en miembros entre el casco y el corvejón), pueden encontrarse en el abdomen ventral, cuello, belfos y en la piel que rodea los ollares; la mayoría se desarrolla más bien con lentitud en sitios en donde se considera que han sido traumatizados previa mente por cortaduras o golpes.

Diagnostico De Laboratorio
Los mucormicetos son comunes en la naturaleza y se encuentran en ocasiones como contaminantes de laboratorio. Varios micólogos han indicado que éstos microorganismos pueden ser invasores secundarios y que muy rara vez son patógenos primarios.

Examen microscópico directo
Mediante el examen de raspados de las superficies de las mucosas y de las lesiones granulomatosas para determinar la presencia de micelio ancho, no septado.

Cultivo
El agar glucosa de saboraud constituye un medio satisfactorio para el aislamiento, restringe la mayoría de los contaminantes bacterianos y ésta característica puede ser incrementada por la adición de antibióticos antibacteriales. La cicloheximida no debe ser añadida al medio ya que los ficomicetos son sensibles a ella.

Pruebas de patogenicidad
Las infecciones experimentales en animales no son útiles en el diagnóstico de laboratorio.

Inmunología
Poco se conoce con respecto a la capacidad del huésped para defenderse contra la enfermedad mucormicótica, por lo general se considera que éstos hongos son apatogénicos, pero que bajo ciertas condiciones son capaces de establecerse en el tejido causando severos cambios patológicos y ocasionalmente una enfermedad fatal, un defecto inmunológico favorece la infección.

11. Candidiasis

Causada por especies del género Candida (comúnmente Candida albicans), es una enfermedad esporádica del tubo alimenticio de las aves de corral, en ocasiones son afectados los cerdos algunas veces con alteración de la piel. Puede causar abortos o mastitis en el ganado. Las infecciones son raras en perros, gatos y caballos.

Signos Clinicos Y Patología
Los signos clínicos en becerros incluyen diarrea acuosa y melena, con subsecuente anorexia, deshidratación y progresión gradual a la postración y la muerte. Las infecciones mamarias bovinas causadas por Candida spp en ocasiones son benignas y transitorias, algunas autolimitantes. Las infecciones más severas siguen después de los tratamientos con antibióticos. Candida tropicalis está asociado en casos de mastitis aguda con grados variables de gravedad, las ubres con hinchazón extensa con una consistencia esponjosa, leche de los cuartos afectados gris y viscosa, temperaturas entre 40º y 42º C, anorexia, claudicación y drástica baja en la producción de leche.

Diagnostico De Laboratorio
Examen microscópico directo
Los raspados de mucosa pueden ser extendidos en un portaobjetos y teñirse con Gram. o preparaciones directas pueden ser
examinadas con lactofenol azul de algodón. Pueden demostrarse células redondas u ovales en gemación de 3-6μ de diámetro y fragmentos de micelio, algunas veces con células en gemación insertadas.

Cultivo
Es esencial que se utilicen medios selectivos para el aislamiento primario; el caldo glucosado y agar saboraud soportan adecuadamente el crecimiento de Candida spp y restringen el crecimiento de diversas bacterias.

Pruebas de patogenicidad
Los conejos y ratones sucumben a la inoculación IV de Candida albicans, pero no existe un empleo práctico de la prueba ya que otras especies de Candida spp pueden causar también la muerte de éstos animales.

Inmunología
No existen pruebas serológicas adecuadas para el diagnóstico de Candidiasis en animales.

Diagnostico diferencial
Como regla general las lesiones cutáneas y de las mucosas en la candidiasis en todas las especies animales, deben ser diferenciadas de las infecciones bacterianas y las dermatofitosis.

Tratamiento
El sulfato de cobre a la dilución de 1:2000 en agua potable ha sido considerado como un tratamiento, algunos veterinarios recomiendan el cambio a nistatina si el sulfato de cobre no es efectivo.

12. Bibliografía

GALINA, Hidalgo Carlos; Reproducción de los animales domésticos; editorial Limusa; I edición; México D.F; 1998; pp 211-219.
JUNGERMAN, Paul F.; Micologia Médica Veterinaria; CECSA; I edición; México D.F.; 1977; pp 95-107;
BLOOD, D.C; Medicina Veterinaria; Editorial Interamericana; IV edición; México D.F; 1974; pp 388-450.
Brucelosis bovina; O.I.E: Office International des Epizooties; http://www.redvya.com/veterinarios/veterinarios/especialidades/bovino/enfermedades/Enfermedad03.htm
Campylobacteriosis genital bovina; O.I.E: Office International des Epizooties;
http://www.redvya.com/veterinarios/veterinarios/especialidades/bovino/enfermedades/Enfermedad04.htm
Tuberculosis bovina; O.I.E: Office International des Epizooties.
http://www.redvya.com/veterinarios/veterinarios/especialidades/bovino/enfermedades/Enfermedad05.htm
DERICAUX J.; Reproducción de los animales domésticos; Editorial Acribia; II edición; zaragoza (España); 1976; pp 409-465.

 

 

 

Trabajo enviado por:
José Angel Parada
ministrocom@yahoo.com
Estudiante Ingeniería de Producción Animal.
Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente.
Universidad Francisco de Paula Santander.
Cúcuta-Colombia.

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