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Viabilidad de Bufo paracnemis ante formol y dicromato de potasio

Resumen: Morfologia externa de Bufo paracnemis. Aparato urogenital. Hábitat y comportamiento. Materiales y métodos. Resultados. Porcentaje de mortalidad. Estadíos alcanzados.(V)
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Autor: Emiliano José Spagnolo

Indice
1. Introducción
2. Morfologia externa de Bufo paracnemis.
3. Aparato urogenital
4. Hábitat y comportamiento
5. Materiales y métodos
6. Resultados 
7. Porcentaje de mortalidad
8. Estadíos alcanzados
9. Referencias

1. Introducción

Gochez Alberto Martín; Spagnolo Emiliano; Peres Luis Orlando; Peralta Nazareno; Najle Sebastian

El objetivo de nuestra investigación, fue medir el rango de viabilidad de embriones de Bufo paracnemis en las concentraciones de formol y dicromato se debió primeramente reconocer las principales características del aparato reproductor y ensayar la manipulación de gametas y fecundación asistida en los citados anfibios.

En nuestro trabajo hacemos un seguimiento a las fases de la ontogenia que se pueden visualizar externamente controlando ciertos factores externos tales como pH, temperatura, cantidad de huevos por cubeta, composición química del solvente, por lo que analizamos el tiempo de crecimiento, el estadío alcanzado, el porcentaje de muertos, y el patrón normal de desarrollo si los factores no difieren mucho, de los encontrados por la naturaleza; con lo cual analizamos el crecimiento de los huevos bajo cambios en la composición química del solvente en cubetas de concentraciones graduales de formol y dicromato de potasio, y calculamos el número de ovocitos muertos y estadío alcanzado.

Suponemos que los estadíos de desarrollo de B. paracnemis serán similares a los de B. arenarum.

La mortalidad de los embriones expuestos a un agente químico será directamente proporcional a la concentración del mismo.

La velocidad de desarrollo de los embriones expuestos a un agente químico será igual a la observada en el control.

Hasta el presente no hay demasiados trabajos sobre la biología de Bufo paracnemis, y mucho menos sobre su desarrollo embriológico. Esto se ve reflejado en lo dificultoso que resultó hallar bibliografía sobre este anfibio. Por lo tanto se considera de particular importancia la realización de esta experiencia como aporte al conocimiento del desarrollo embrionario de Bufo paracnemis y los factores que interfieren en el mismo. En este caso se utilizaron soluciones de formol y dicromato de potasio que son considerados como mutágenos químicos (Lacadena, J. R., 1989)

Las características morfológicas y ecológicas del material biológico en estudio son las siguientes:

Bufo paracnemis es un anfibio robusto, con cabeza ancha, hocico redondeado, casi triangular. Crestas cefálicas muy fuertes y abultadas. Ojo mediano, con un pliegue sobre el párpado superior. Tímpano visible. Parotoides muy grandes y abultadas, aguzandose posteriormente. Machos con patas delanteras desarrolladas, mano con reborde cutáneo; tubérculos metacarpales desarrollados; los subarticulares semidivididos. Pie con membrana interdigital hasta 1/3 y reborde cutáneo; tubérculo metatarsal interno en forma de azada, el externo redondeado. Pliegue tarsal afilado. Piel dorsal áspera, con verrugas romas con puntas córneas, vientre con gránulos poligonales con punta espinosa. Glándula paracnemis (tibia) grande. Macho con saco vocal externo poco visible y cayosidades nupciales oscuras. Dorso amarronado o amarillento con manchas marrón oscuro brillante, transversales. Parotoides rodeadas por machas oscuras alargadas. Manchas oscuras borrosas en extremidades. Vientre y garganta blancuzcos, densamente salpicados de oscuro. El tamaño promedio del adulto es de 210 mm (W. S. Monografía 2, 1980).

El sistema urogenital de este anfibio comparte las características comunes a los de todos los anuros (ver figura 1), (Pirlot, P, 1976)

2. Morfologia externa de Bufo paracnemis.

 

3. Aparato urogenital

4. Hábitat y comportamiento

Reproducción: desde primavera temprana hasta verano tardío. Los huevos son puestos en largas ristras gelatinosas adheridas a plantas acuáticas.

Renacuajo: dorso gris azulado. Vientre blancuzco. Aleta dorsal mas clara, casi opaca. Cola levemente mas larga que la mitad del largo total. Ojos grandes, prominentes. Fórmula dentaria 1,1-1/1-1,2.

Distribución: desde Jujuy hasta Córdoba y Santa Fe, Corrientes, Entre Rios y Misiones (ver anexo 1, figura 2) .Además en ambientes secos de Bolivia, Paraguay y Brasil hasta Pernambuco (W. S. Monografía 2, 1980).

Su ubicación taxonómica es la siguiente:

Clase: Amphibia

Subclase: Lissamphibia

Orden: Anuro

Superfamília: Bufonoidea

Familia: Bufonidae

Grupo: Marinus

Género y especie: Bufo paracnemis

(De Lucía, A; comunicación oral, 1999).

5. Materiales y métodos

Dos días antes del comienzo de la experiencia fueron colectados ejemplares macho y hembra de Bufo paracnemis, los cuales se trasladaron al laboratorio del área Morfología y Fisiología para que se les suministre a las hembras una suspensión hipofisiaria (según el protocolo de Houssay, 1929) para inducir la ovulación.

Pasadas las doce horas, las hembras comenzaron a ovular, tras haberse iniciado esto se desmedularon tanto los ejemplares hembra como machos. A estos últimos se los disecó para extraerles los testículos, los cuales fueron seccionados y macerados en 1 ml de solución Ringer al 10 % (ver anexo 1, tabla 1), retirando luego con una pinza los sobrantes de tejido y para obtener así la suspensión espermática.

Se colocaron los ovocitos contenidos en un ovisaco de una de las hembras en una caja de Petri (perfectamente limpia y seca), y se les agregó luego una primer dosis de suspensión espermática. Transcurridos 10 minutos se agregó 1 ml de solución de Ringer, al minuto siguiente se agregó la segunda dosis de suspención espermática preparada a partir del otro testículo del macho. Quince minutos mas tarde fueron colocados los ovocitos fecundados en un recipiente plástico, translúcido, de medidas 25 x 12 x 5 cm., para luego ser cubiertos totalmente con solución Ringer.

Simultáneamente se prepararon dos cubeteras de plástico conteniendo soluciones de concentraciones decrecientes de formol y dicromato de potasio. Estas soluciones de diferente concentración fueron ordenadas de a pares en los recipientes de las cubeteras, de forma que dos recipientes contenían la misma concentración de agente químico (ver figuras).

Sol. De Ringer Tris HCl 10% (pH 7,5):

NaCl

0,66 gr

KCl

0,015 gr

CaCl2

0,015 gr

Agua destilada

Csp. 1000 ml

Tris 1M

10 ml

Figura 2: Distribución de las soluciones en las cubeteras.

Cubetera Con Formol

Concentraciones:

1: 4%

2: 2%

3: 1%

4: 0,4%

5: 0,04%

6: 0,004%

Cubetera CON K2Cr2O7

Concentraciones:

1: 0,00003 gr/l

2: 0,0003 gr/l

3: 0,003 gr/l

4: 0,03 gr/l

5: 0,3 gr/l

6: 3 gr/l

Vale aclarar que los embriones no cumplimentaron su desarrollo en el medio conteniendo los agentes químicos, sino que este medio fue reemplazado a las 10 horas desde la inseminación por solución de Ringer, ya que la solución inicial sufrió una evaporación excesiva. De igual modo, tanto las soluciones Ringer de las cubeteras como la del control se reemplazaron periódicamente para renovar el suministro de nutrientes y evitar la putrefacción del medio.

Cuando los embriones alcanzaron el estadío de "boca abierta" fueron alimentados con hojas de lechuga (Lactuca sativa) y con hojas de una planta acuática hervidas.

Los datos registrados durante la experiencia fueron: registros de temperatura ,con termómetro de mercurio; de pH con tiras indicadoras de diferentes marcas; porcentaje de muertos por recipiente de cría y estadío máximo alcanzado al tiempo de muestreo.

Periódicamente se tomaron muestras representativas de todos los recipientes que fueron fijadas y conservadas en formol al 4%. Estas muestras fueron tomadas a distintos intervalos de tiempo que fueron predeterminados (ver tabla ).

Crecimiento embrionario

HORAS

Experiencias

Cuba Madre

0 hs.

 

 

0,5 hs.

medialuna gris

medialuna gris

1,5 hs.

prim división

prim división

2 hs.

 

 

3 hs.

4 blastómeros

4 blastómeros

4 hs.

blastómera(8)

blastómera(8)

5 hs.

blástula tem

blástula tem

6,5 hs.

blástula tard

blástula tard

10,5 hs.

blastoporo

blastoporo

22 hs.

gástrula

gástrula

28 hs.

gástrula media

gástrula media

33 hs.

gástrula media

gástrula media

46,5 hs.

gástr.tard/neur.

gástrtar/neur

55 hs.

neurulación

neurulación

56,5 hs.

neur/br. Caudal

neurulación

59,5 hs.

resp. Musc.

brote caudal

75,5 hs.

lat.card/circ. Branq.

resp.musc./b.caud.

99,5 hs.

boca abierta

latido cardiaco

123 hs.

pliegue opercular

 

148,5 hs.

operculo cerrado

boca abierta

166 hs.

operculo completo

pliegue opercular

 Los esquemas fueron realizados a mano alzada, con lupa Kyowa a 30x y 40x.

Las tablas fueron realizadas con el programa Excel 98.

6. Resultados

El pH no varió significativamente a lo largo de la experiencia, estas pequeñas variaciones se atribuyeron a que se utilizaron distintas marcas de tiras indicadoras.

La temperatura osciló entre los 18 y 27 ºC, presentando una media a lo largo de la semana de 23 ºC. La mínima se registró a las 22 horas de desarrollo y la máxima a las 123 h.

7. Porcentaje de mortalidad.

Cuba control.

Se comenzó la experiencia con 2100 ovocitos (calculados con método de muestreo).

El porcentaje de mortalidad se mantuvo entre el 5 y el 14 % hasta las 55 horas, pasadas las cuales se registró un 90% de mortalidad a las 75 horas, para mantenerse luego entre el 20 y 29 % (ver tabla).

Luego de las 166 horas ha sobrevivido el 1,2 % de los embriones de la cuba control.

Cubetera con dicromato de potasio.

HORAS

pH

Temp

% muertos

% muertos

% muertos

% muertos

% muertos

% muertos

cuba 1

cuba 2

cuba 3

cuba 4

cuba 5

cuba 6

3 hs.

7

24

4 hs.

7

23

5 hs.

7

23

8%

12%

5%

6,5 hs.

7

23

10,5 hs.

6

24

8%

12%

25%

22 hs.

6

18

4%

14%

21%

28 hs.

6

24

33 hs.

6

23

4%

4%

16%

46,5 hs.

6

20

55 hs.

6

23

11%

13%

12%

22%

100%

56,5 hs.

5

23

59,5 hs.

6

24

12%

75,5 hs.

7

23

14%

5%

45%

6%

99,5 hs.

6

26

31%

14%

123 hs.

7

27

8%

50%

55%

100%

148,5 hs.

6

25

 Cubetera con dicromato de potasio:

Porcentaje de mortalidad:

Cuba número 1: 41% de muertos

Cuba número 2: 72 % de muertos

Cuba número 3: 45% de muertos

Cuba número 4: 60 % de muertos

Cuba número 5: 100 % de muertos

Cuba número 6: 100 % de muertos

(ver tabla).

% muertos

% muertos

% muertos

% muertos

% muertos

% muertos

HORAS

pH

Temperatura

cuba 1

cuba 2

cuba 3

cuba 4

cuba 5

cuba 6

0 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

0,5 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

1,5 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

2 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

3 hs.

7

24

 

 

 

 

 

 

4 hs.

7

23

 

 

 

 

 

 

5 hs.

7

23

8%

 

 

12%

 

5%

6,5 hs.

7

23

 

 

 

 

 

 

10,5 hs.

6

24

8%

 

 

12%

 

25%

22 hs.

6

18

4%

 

 

14%

 

21%

28 hs.

6

24

 

 

 

 

 

 

33 hs.

6

23

4%

 

 

4%

 

16%

46,5 hs.

6

20

 

 

 

 

 

 

55 hs.

6

23

11%

13%

 

12%

22%

100%

56,5 hs.

5

23

 

 

 

 

 

 

59,5 hs.

6

24

 

 

 

 

12%

 

75,5 hs.

7

23

14%

5%

5%

6%

 

 

99,5 hs.

6

26

 

31%

 

 

14%

 

123 hs.

7

27

8%

50%

 

55%

 

 

148,5 hs.

6

25

Cubetera con formol:

Porcentaje de mortalidad:

Cuba 1,2,3 y 4 quedaron fijadas.

Cuba 5 y cuba 6 presentaron un 43 % de mortandad.

(ver tabla).

% mue

% mue

% mue

% mue

% mue

% mue

HORAS

pH

Temperatura

cuba 1

cuba 2

cuba 3

cuba 4

cuba 5

cuba 6

0 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

0,5 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

1,5 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

2 hs.

 

 

 

 

 

 

 

 

3 hs.

7

24

 

 

 

 

 

 

4 hs.

7

23

 

 

 

 

 

 

5 hs.

7

23

 

 

 

 

5%

 

6,5 hs.

7

23

 

 

 

 

 

 

10,5 hs.

6

24

 

 

 

 

 

 

22 hs.

6

18

 

 

 

 

 

 

28 hs.

7

23

 

 

 

 

 

 

33 hs.

6

23

 

 

 

 

 

 

46,5 hs.

6

23

 

 

 

 

11%

6%

55 hs.

6

23

 

 

 

 

 

35%

56,5 hs.

5

23

 

 

 

 

 

 

59,5 hs.

6

24

 

 

 

 

 

 

75,5 hs.

7

23

 

 

 

 

12%

 

99,5 hs.

5

23

 

 

 

 

21%

7%

123 hs.

6

27

 

 

 

 

 

 

148,5 hs.

6

26

8. Estadíos alcanzados

En la cubeta control el último estadío observado luego de las 166 horas de trabajo fue el de pliegue opercular.
En las experiencias de dicromato de potasio y formol se llegó al mismo tiempo al estadio de opérculo completo.
En las cubas con tratamiento los embriones alcanzaron estadios más adelantados que los logrados por los de la cuba control.
El porcentaje de muertos resulta ser mucho mayor en la cubeta madre.

9. Referencias

Cabrera; Maluquer; Lozano. Historia Natural Tomo I: Zoología. 5º Edición, Inst. Callach de Lib. y ediciones. Barcelona. 1966.
De Lucia, A. Clase teórica de Embriología General. Lic. en Genética F.C.E,QyN.1999.
Enciclopedia Salvat de las ciencias, Animales Vertebrados, Tomo 19. Salvat S. A. Pamplona. 1968.
Juan Ramón Lacadena. Genética. 4º edición. Editorial AGESA. 1988
N.H. Freeman, B. Bracegirdle. Atlas de Embriología. Paraminfo. Madrid. 1975
Pirlot, P. Morfología Evolutiva de los Cordados. Ediciones Omega, S. A., Barcelona. 1976
Stetson R. Apunte práctico de Biología Animal de Lic. en Genética y Profesorado en Biología. F.C.E,QyN. U.Na.M. 1999.
W. S. Monografía 2. Monitore zoologico italiano. Pubblicatto dalla universita degli studi di Firenze con il contributo del Consiglio Nazionale Delle Richerche. Italia. 1980.
Wylliam Montagna. Anatomía comparada. 3º edición. Editorial Omega S.A. 1973.

 

Autor:
Emiliano José Spagnolo
amghotam@hotmail.com

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