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Determinación del índice de Bacterias coliformes totales y fecales en muestras de alimentos y determinación del índice de Estreptococo del grupo "D" en muestras de alimentos

Resumen: Terminología. Óptica moderna. Recuentos de microorganismos viables "Totales". E. Coli y Coliformes. Bacterias Coliformes, como indicadores de la calidad higiénica de las Alimentos. La prueba de los Coliformes. Estreptococos del grupo mitis-salivarius.(V)
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Autor: Ing. Sixto Urbaneja

Indice
1. Introducción
2. Terminología.
3. Óptica moderna
4. Recuentos de microorganismos viables "Totales"
5. E. Coli y Coliformes
6. Bacterias Coliformes, como indicadores de la calidad higiénica de las Alimentos.
7. La prueba de los Coliformes.
8. Estreptococos del grupo mitis-salivarius
9. Conclusión.
10. Bibliografía

1. Introducción

Mediante la realización de este trabajo, se va a desarrollar el índice de bacterias coliformes totales y fecales en muestra de alimentos; en el cual se nombran y definen los principios, metodología de E Coli, (coliformes), Bacterias coliformes como indicadores de la calidad higiénica de los alimentos, la prueba de coliformes y otros parámetros para detectar microorganismos patógenos y no patógenos en muestras de alimentos.
Por otra parte se determina también Estreptococos del grupo "D" presente en una muestra de alimentos, los cuales realizan recuentos, prueba, se nombra principio y metodología, que pueden llegar a nombrar muchas formas de desarrollar microorganismos en muestras de alimentos.
A partir de 1920, se introdujo la utilización del grupo total de las bacteria del grupo coli-jerogenes o coliformes como marcadores en análisis microbiologico de la leche pasteurizada y de los helados, basándose en el principio de que un tratamiento térmico adecuado habría de eliminar todas las bacterias presentes en este grupo y de que el envasado debería impedir la recontaminación del producto.

2. Terminología.

Para resolver estos problemas, el científico, Ingram; recomendó la distinción de dos grupos de microorganismos marcadores ("marker. organisms"). En primer lugar, el grupo cuya presencia en un alimento indica la posible presencia simultanea de microorganismos patógenos ecológicamente relacionados. Tales organismos marcadores son denominados índices. Desde entonces como índice de posible presencia de microorganismos patógenos de procedencia entérica (entre ellos, Salmonella) en el agua y los alimentos.
Mucho mas tarde, se introdujeron ciertos grupos de bacterias con el propósito de poner de manifiesto deficiencias en la calidad microbiología de un determinado alimento en términos mas generales.
Por supuesto que un determinado marcador puede funcionar como índice o indicador, incluso en un mismo alimento. Por ejemplo, la presencia de números significativos de ufc de e. Coli en camarones o gambas precocidos y congelados pone de manifiesto: a) un tratamiento de inocuidad inadecuado, por lo tanto función indicadora, b) Presencia posible de indicadores de microorganismos patógenos de procedencia enterica, función de índice para microorganismos significativos en cuanto a la salud, riesgo derivado de las industrias donde camarones fueron procesados.

3. Óptica moderna

En el momento actual, es posible la determinación directa de casi todos los microorganismos patógenos entericos. No obstante, existe todavía en la microbiología moderna analítica de los alimentos para pruebas o determinaciones adecuadamente diseñadas de microorganismos marcadores, a demás de buscar o aislar microorganismos patógenos.
Damos algunas razones que lo justifican:

  • El fallo en la decepción de entorobacteriacea patógenas concretas tienen un significado alto (limitado), debido a la frecuente distribución muy irregular de estos microorganismos en los alimento y a la falta de fiabilidad de las tecnicas de aislamiento.
  • Por otro lado, no es posible en un laboratorio no especializado detectar la presencia en los alimentos de ciertos agentes patógenos entericos, tales como el virus de la hepatitis a, y los helmintos.
  • Además, aun cuando falten en efecto todos los agentes patógenos entericos en una alicuota adecuada de una partida de alimentos este resultado tiene únicamente significado de lo que se refiere a partida o lote en cuestión.

Determinación del índice de bacterias coliformes totales y fecales en muestras de alimentos.

  • Utilización de los microorganismos marcadores (Indices e Indicadores).

Introducción Histórica, terminología y Bases de su utilización.

Historia.
La utilización de ciertos gérmenes del grupo coli-aerogenes como indicadores de contaminación de origen fecal del agua, y de los alimentos en una práctica establecida desde hace muchos años. Primero se aplicaron al agua, después a la leche, a helados, a los moluscos bivalvos y a otros alimentos. De forma independiente ekl científico Schardigeren Austria, en 1982 en Estados Unidos, dijo que las aguas potables deberían ser examinadas en busca de lo que mas tarde se llamara Eschericha Coli, en lugar de investigar la presencia de Enterobacteriaceae patógenas especificas, en particular Salmonella Tyfhy, empresa en aquel tiempo difícil.

4. Recuentos de microorganismos viables "Totales"

Los recuentos "totales" expresan el número por gr o ml de (ufc), de alimentos obtenido en determinadas condiciones de cultivo en medio sólido incubado en aerobiosis. No existe una relación directa entre la flora aerobia y la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos de procedencia intestinal, ni tampoco de otros agentes de infecciones e intoxicaciones alimentarias de diversas procedencia. En realidad un recuento alto de ufc en un alimento indica que, probablemente, ha estado conservado en condiciones de tiempo y temperatura que han permitido el desarrollo de microorganismos. La simplicidad de la técnica hace que el recuento de la placa en flora aerobia viable sea un paso inicial frecuente en el análisis microbiológico de los alimentos.
Es importante primero, elegir adecuadamente la temperatura de incubación. En segundo lugar, ha de utilizarse un medio de cultivo adecuado. En alimentos no obtenidos por fermentación, conviene un agar infusión que permitirá incluso el crecimiento de los microorganismos de cultivo más difícil, por ejemplo el medio de uso múltiple con tween 80 ("all purpose tween= APT) ó el agar tamponado glucosa treptona peptona de soya con extracto de levaduras.
En alimentos congelados y en los conservadores en refrigeración, los recuentos de la flora bacteriana psicrotrofa pueden relacionarse con las condiciones de conservación y son indicativos de la calidad bacteriológica en estos productos.
En algunos alimentos tales como, los envasados al vacío, esta indicado el recuento de la flora anaerobia mesófila, no debe utilizarse el tioglicolato sódico en los medios para el recuento de anaerobios.

5. E. Coli y Coliformes

Principios. Las investigaciones ecológicas han puesto de manifiesto que E. Coli, procede del intestino de hombre y de los intestinos de los animales de sangre caliente, si bien puede sobrevivir y aun multiplicarse en determinados substratos. Del origen fecal de E. Coli, se concluye que si esta bacteria se encuentra en algún alimento ello indica que han tenido lugar una contaminación de origen fecal y que, consiguientemente, existe el riesgo de que hallan llegado al alimento en cuestión microorganismos patógenos de procedencia enterica.
En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienización eficaz, que asegura su inocuidad para el Consumidor, por lo general, la determinación de coliformes o gérmenes del grupo coliaerógenes: gérmenes que, incubados a 37° C, fermentan la lactosa con producción de gas en un medio, con verde brillante y 2 % de bilis. Ya hemos señalado antes que esta determinación no tiene necesariamente relación con una contaminación de origen fecal y consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos de procedencia entérica, sino que es sólo una indicación de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial de los alimentos.
Se utiliza a veces también la denominación "coliformes fecales" refiriéndose a los microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contiene sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5 °C.

Metodología.- E. coli.
La determinación de este microorganismo en los alimentos no presenta problemas analíticos especiales. Cuando su número supera claramente la cifra de I/ml ó de I0/gr, en el Caso de un alimento sólido, puede ensayarse una técnica de recuento directo. Se ha demostrado sin lugar a dudas que la utilización del agar de MacConkey a 44
± 0,1°C, en anaerobiosis es el método de elección de las colonias obtenidas en este medio, una proporción adecuada, entre 3 y 10 por placa o bolsa, se someten a la prueba de Mackenzie-Taylor-Gilbert (MTG): formación de gas a partir de la lactosa en caldo verde brillante bilis lactosa Y producción de endol a partir de péptidos conteniendo triptófano, en ambos Casos a 44°C.
Cuando el número de células de E. coli en los alimentos sea muy inferior al señalado más arriba, procede realizar las pruebas de presencia o ausencia o una determinación por el método del NMP. También en estos caso se cuenta con una técnica fiable. Primero se lleva a cabo el enriquecimiento en el clásico caldo lactosado bilis verde brillante y después agar de MacConkey que se incuba a 44°C.

Coliformes. - Metodología.
Como ya hemos señalado repetidamente, el grupo coli-aerogenes no está definido de una manera precisa. Por lo tanto los resultados dependen en gran medida del método utilizado. La razón de la conveniencia de esta determinación, de sus partidarios, reside en una mayor facilidad de ejecución.
Existen dos técnicas perfectamente estandarizadas tanto para el recuento directo de Ufc del grupo coli-aerogenes como para la prueba de presencia o ausencia (PA). Las primeras emplean un agar tipo bilis lactosa de MCConkey y sus modificaciones. La segunda hace uso de un caldo bilis verde brillante ó lauril sulfato lactosa. La temperatura de incubación varia de 30 a 37 "C. Los niveles de identificación aplicados (presunción, confirmación Y terminación o pruebas finales).

6. Bacterias Coliformes, como indicadores de la calidad higiénica de las Alimentos.

El empleo de coliformes como indicadores de organismos patógenos en el agua es una práctica vigente en la actualidad.
Las bacterias Coliformes, comprenden la E. Coli y Enterobacter aragenes. Ambos organismos son bacilos cortos, gram, negativo que fermentan la lactosa con producción gas. E. Coli tiene su localización primaria en el tracto intestinal del hombre y de los animales, y de allí su nombre Coli, que deriva del colon. E. Coli se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los animales, donde no suele causar enfermedad.
Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higiénica de los alimentos, se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El hallazgo de gran número de organismos el los alimentos y en el agua indica la polución o contaminación fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de carácter intestinal la presencia de polución indica la posibilidad de que existan agentes etiológicos productores de estas enfermedades.

7. La prueba de los Coliformes.

Se utiliza dos tipos de procedimientos para hacer la prueba de los coliformes. Son el procedimiento del numero mas probable (MPN), y el de filtración a través de una membrana (MF). El método (MPN) emplea medio de cultivo liquido en tubos de ensayos a los cuales se añaden las muestra de H2O de bebidas. En el método mas común por filtración (MF), la muestra de H2O se pasa a través de un filtro de membrana estéril, que tiene las bacterias (véase en la fig. 8.9) y luego el filtro se encuba en un medio de cultivo. Cuando se utiliza el método del filtro de membrana para el agua bebida, deben filtrarse al menos 100 ml de agua, aunque en sistemas de aguas limpias pueden filtrarse volúmenes mayores.
En sistemas de abastecimientos de aguas bien regulados, los ensayos de coliformes son siempre negativos. Si los resultados no son uniformemente negativos, se han producido una alteración en el sistema (como en la aclaración) o en la red de distribución (en los cañerías).
Los parámetros estándares para el agua de bebidas, están especificados en la ley de agua potable segura. Que facilita el desarrollo de estándares para el agua potable por parte de la epa (Agencia para la protección del Ambiente).
Determinar el indice de estreptococos del grupo "D" en una muestra de alimento.
Principios. Existe una evidente imprecisión en el uso de los términos estreptococos fecales, estreptococos del grupo D de Lancefield y enterococos. Bajo la denominación de enterococos se Comprenden las especies Str. faecalGv y Str. farcium con sus variedades o subespecies. Junto con Str. boris y Str. equinus integran los estreptococos del grupo D de Lancefield.
El término estreptococos fecales es más impreciso desde el punto de vista taxonomico, puesto que comprende en realidad, además de los estreptococos del grupo D, algunos otros estreptococos cuya habitad es el intestino humano y animal. En los medios mas selectivos crecen únicamente los enterococos, por ser mas resistentes en habitas extraentéricos. Según lancefield, todos los estreptococos del grupo D se encuentran en las heces. Por ello, aparece más adecuado que los medios de cultivos utilizados permitan el crecimiento de todos estos gérmenes y no solo de los más resistentes. Aunque su procedencia es fecal, el hecho de que los estreptococos de grupo D sean muy resistentes en habitas extraentéricos determina que su procedencia en los alimentos no pueda relacionarse con una contaminación de origen fecal, al menos reciente, ni consiguientemente con la presencia simultanea de microorganismos patógenos de procedencia enterica.

Metodología.
La detección o enumeración de los estreptococos del grupo D, mejoró de modo considerable desde que se adoptó una combinación del sistema indicador esculina/hierro de Rochaix con inhibidores tales como la azida y las sales biIiares. Y más particularmente, la azida y la kanamicina. Tales medios son muy adecuados para siembra en superficie. Además, pueden utilizarse a continuación de la reparación sobre medio sólido.
En la enumeración de estreptococos del grupo D de Lancefield a partir de alimentos en los que estos microorganismos hayan sufrido lesiones subletates.
El ennegrecimiento alrededor de las colonias constituye una pista razonable para sospechar que pertenecen a estreptococos del grupo D. La confirmación de las colonias sospechosas se basa, fundamentalmente, en el crecimiento rápido en un medio liquido adecuado a 45
± 0,1" C y en la morfología de los gérmenes: cadenas cortas de cocos catalasa negativos. Estos caracteres son de máximo valor para reconocer las colonias pertenecientes al genero Aerococcus, que crecen bien en los mencionados medios, y descartarlas o tomarlas en consideración, según aconseje la ecología del alimento en cuestión. Una identificación más completa puede llevarse a cabo por Comprobación del Crecimiento en presencia de 40% de bilis.
Los alimentos de origen animal y vegetal obtenidos por fermentación microbiana contienen frecuentemente números considerables de estreptococos del grupo "D", que forman parte de su asociación microbiana natural.

8. Estreptococos del grupo mitis-salivarius

Principios. Del mismo modo que de la presencia en los alimentos de algunos miembros de origen fecal de la familia de las Enterobacteriaceae se puede inferir este tipo de contaminación, la presencia de microorganismos típicos del tracto buco-respiratorio puede indicar contaminación de este origen.
Hay también un pequeño grupo de estreptococos, el llamado grupo mitis-salivarius, que puede utilizarse como indicador de contaminación de origen bucal. En la saliva, las especies más frecuentemente encontradas son Str. mitis, Str. salivarius y. Str. sanguis. Los estreptococos del grupo miIissalivarius comparten algunas propiedades con los estreptococos del grupo D.
Las determinaciones de los estreptococos del grupo mitissalivarius son útiles para evaluar la contaminación de los ambientes donde se manipulan alimentos, en particular en el sector de la alimentación para colectividades, por ejemplo en los establecimientos de cafetín y en las áreas de preparación de alimentos de los hospitales.
Metodología. Para su detección en los alimentos se utiliza el agar tamponado sacarosa sustrato azul tripán cnstal violeta y la incubación se hace a 37 °C. El grupo mitis-salivarius forma por siembra en superficie del referido medio colonias azules o azul pálido, pero nunca azúl oscuro o negras.
En los casos de duda, es conveniente llevar a cabo una tinción por el método de Gram y realizar la prueba de la catalasa ,junto con otras pruebas, De modo que puedan descartarse los estreptococos del grupo D, las Enterobacteriaceue y los estafilococos. Estas bacterias no crecen normalmente sobre el mencionado medio selectivo o si lo hacen sus colonias tienen caracteres bien diferenciados.

Streptococos y otros cocos.
Algunos miembros son patógenos para los humanos y otros animales. Como productores de ácido láctico, algunos estreptococos desempeñan importantes funciones en la producción de leche ácida, ensilados y otros fermentados.
Para distinguir los estreptococos no patógenos de las especies patógenas, el genero streptococus se ha dividido en 3 grupos o generos.
El genero laclococcus, comprende estreptococos importantes para la industria Láctea, mientras que el genero enterococus, comprende estreptococos que son principalmente de origen fecal.
Los organismos que han quedado en el genero streptococcus, se han dividido a su vez en dos grupos de especies relacionadas. La hemólisis en agar de sangre es de considerable importancia en la subdivisión del genero. Las colonias de las cepas que producen estreplolisina O o S, están rodeadas por una gran hemólisis completa de los glóbulos rojos de la sangre, condición que se conoce como
b hemólisis.
Por otra parte, muchos estreptococos y los lactococos y enterococos no producen hemolisina pero causan, en cambio, la formación de la zona verdosa o pardusca alrededor de las colonias en agar sangre, fenómeno que se debe no a una verdadera hemólisis sino a una decoloración y perdida de potasio por los hamaties. Este tipo de reacción se ha denominado clásicamente
a hemólisis.

9. Conclusión.

Podemos concluir con respecto a los objetivos antes relacionados que la determinación de bacterias coliformes fecales y totales, pueden estar presentes tanto en los alimentos como en los sistemas de agua potable, ya que estos microorganismos se pueden transmitir a través de las heces fecales.
La mayoría de los enterococos, estreptococos y demás grupos o géneros microbianos son algunos patógenos y no patógenos, de estos se pueden preparar fermentaciones, que mediante un largo proceso, llegan a ser elaboradas en productos comestibles, garantizando al consumidor la mayor seguridad al consumir ese producto fermentado.

10. Bibliografía.

García, Monses. Microbiología de los Alimentos. Pág. 144-148. y otros.
J.M. J.A.Y. Microbiología Moderna de los Alimentos Pág. 301-306 y otros.

 

 

Trabajo enviado por:
Ing. Sixto Urbaneja
sixtoa@cantv.net

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