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Seminario - Producción de Aceite y Grasa por Fermentación

Resumen: El siguiente trabajo tiene como objetivos: Conocer los tipos de microorganismos que son útiles para la fabricación de aceites y lípidos. Conocer las características de los aceites y grasas producidos por los microorganismos. Conocer algunas de las especies de los diferentes géneros, que están involucrados en la síntesis de lípidos y mostrar alguna de sus características. Conocer algunas de las características de los medios de cultivo y equipos que se utilizan en la síntesis de lípidos microbianos.(V)
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Autor: Sebastián Acuña Verrugio

Índice

  1. Objetivos
  2. Revisión bibliográfica
  3. Anexo: Cultivo a escala laboratorio de algas
  4. Anexo: Fotografías de microorganismos productores de lípidos
  5. Conclusiones
  6. Bibliografía

     

OBJETIVOS

  • Conocer los tipos demicroorganismos que son útiles para la fabricación de aceites y lípidos
  • Conocer las características de los aceites y grasas producidos por los microorganismos
  • Conocer algunas de las especies de los diferentes géneros, que están involucrados en la síntesis de lípidos y mostrar alguna de sus características.
  • Conocer algunas de las características de los medios de cultivo y equipos que se utilizan en la síntesis de lípidos microbianos.

REVISIÓN BIBLIOGRAFICA

No todos los microorganismos pueden ser considerados comofuente abundante de aceites y grasas, ya que para permanecer como células vivasestas necesitan de un contenido mínimo de lípidos en sus membranas y en suestructuras membranosas. Aquellos microorganismos que albergan gran cantidad deaceite se les suele llamar oleaginosos. De las diferentes especies de levaduras( 600 ), sólo 25 suelen acumular algo más que 20% de lípidos y de las 60000especies de mohos solo 50 acumulan más de 25 % de lípidos. Los lípidosacumulables por los microorganismos son principalmente trilgliceroles, por loque esto se debe tomar en cuenta para optimizar la producción cuando se quiereotros tipos de lípidos.

Los procesos para acumular lípidos en mohos y levadurascomenzaron en la época de los 30 y 40 ‘s

Se ha encontrado que microorganismos tales como bacterias,levaduras y mohos, así como algas sintetizan en condiciones adecuadas decultivo entre el 25 % y el 70 % de su peso seco en forma de grasas. Hasta elmomento la obtención de las necesidades lipídicas humanas se basa por laobtención de grasas y aceites a partir de animales o vegetales ,las que de porsí son mucho más baratas. Aunque no hay que descartar la obtención de estaspor microbios, ricas en aceites grasos esenciales, principalmente si seconsideran que en el futuro pueden escasear estas o podrían servir para laalimentación animal.

Otra utilización de estas grasas y aceites esenciales es laobtención de detergentes, que también pueden ser sintetizados biotecnológicamentecon microorganismos y la obtención de biocombustibles sustitutos del petróleo,se ve como una alternativa valida en algas.

La síntesis de ácidos grasos, tiene lugar, igual que ladegradación oxidativa de parafinas para obtener ácidos grasos, a través delproducto intermediario acetil CoA, solo que en sentido inverso con gasto deenergía de síntesis. En el cultivo en parafinas estas pueden incorporarsedirectamente a las grasas sin síntesis de novo , tras su oxidación a ácidosgrasos y una eventual y restringida elongación de la cadena carbonada.

Además de las parafinas también son adecuados para laobtención de grasas los sustratos azucarados principalmente.

Fig : degradación microbiana de n- parafinas

De las levaduras son especialmente adecuadas las especies deCandida, Lipomyces, Rhodotorula, Endomyces, Lipomyces; las bacterias que sonbuenas formadoras de grasas, tenemos Streptococus, Enterobacter, Bacillus,Mycobacterium, Pseudomonas; para el caso de los mohos las especies de Mucor,Rhizopus, Penicillium, Aspergillus y Fusarium.

Además de elegir las cepas adecuadas, son importantes sobretodo los sustratos pobres en nitrógeno y fósforo para que haya unalmacenamiento importante de grasas en la célula microbiana. Por ello en muchaslevaduras la mejor síntesis de grasas se consigue cuando el medio de cultivotiene un contenido de nitrogeno de un 50 – 70 % por debajo del contenido óptimo.

Las bacterias para la obtención de grasas se cultivan enmedios muy ricos en azucares, intensamente aireados, frecuentemente añadiendoglicerina y con un aporte que suponga sólo el 25 – 40 % del nitrógeno óptimo.Las células de las distintas especies contienen así un 25 – 30 % de grasascon los ácidos esteáricos, palmítico y oleico.

Lamentablemente los porcentajes de producción de ácidosgrasos son bastante bajos, con respecto a los otros géneros; sin embargo sepueden rescatar distintos esfuerzos en este sentido su aplicación comercialapunta a la generación de aceites y alcoholes que puedan ser usados en petroquímica.

Con las levaduras productoras de grasas, puede obtenersehasta un 50 – 74 % de las mismas.

Un típico patrón de crecimiento en cultivo batch puedeverse en la figura

Fig: Patrón típico de acumulación lipídica para una levadura (RhodotorulaglutinispR. gracilis), crecimiento con un medio con alta razón deC:N ; todo esto en cultivo batch

( cuadrado negro: biomasa; Cuadrado blanco: contenido porcentual de lípido;círculo: NH4+ presente en el medio )

(de YOON et al., 1982).

Se aprecia que a medida que medida que disminuye laconcentración de nitrógeno, se produce una marcada acumulación de lípidos enel cultivo ( 24 – 48 hrs ). Las células sólo empiezan a transformar elsustrato en grasas de reserva sólo cuando la reserva de nitrógeno en el mediose ha agotado y han terminado por lo tanto la síntesis de proteína y por lotanto el crecimiento. En el caso de las levaduras, la asparigina y el ácido aspárticoson especialmente apropiados como fuente de nitrógeno para producir una altaproducción de grasas

La acumulación de lípidos también ha sido examinada en uncultivo continuo de 1 etapa y el perfil de acumulación depende también de larazón de dilución, razón de crecimiento mostrada en la figura. Al igual queen el cultivo batch el medio tiene que estar formulado con una alta razón decarbono: nitrógeno, la que debe ser de 50 : 1 o mayor. El cultivo debe teneruna razón de crecimiento absoluto de mas menos un 25 a 30 % de el máximo. Bajoestas condiciones la concentración de nitrógeno en el medio es virtualmentenula y entonces el organismo tiene suficiente tiempo de residencia dentro delquimiostato para asimilar el exceso de carbono y convertirlo en lípidos.

La razón de producción de lípidos ( gramos / Litro-1 *hora-1 ) es usualmente más rápida en cultivos continuos que enbatch’s únicos.

Fig: Patrón típico de acumulación para levadura (Rhodotorulaglutinis) ,creciendo en un medio limitante de nitrógeno, en cultivo continuo

( cuadrado negro: biomasa; Círculo: contenido porcentual %de lípidos )

La razón exacta de carbono y nitrógeno fue elegida para queel nitrógeno limitante y el exceso de carbono fuera metabolizado en forma de lípidos.

Aunque el más alto contenido de lípidos de la célula 50 %peso/peso fue obtenido con una razón de 50: 1 o superior, la razón óptimapara la máxima productividad (gr L-1 h-1 lípidos )fuecon la tasa de 25 : 1 con glucosa y de 30 – 35 : 1 cuando fue usado permeadode suero como sustrato con la misma levadura.

Similares resultados para describir la razón óptima de C:N, para obtener la mejor acumulación de lípidos , fueron investigados conRhodotorula glutinis.

Otra característica importante es la acumulación decarbohidratos en un 20 %, en células con un 50 % de lípidos, asumibles comouna condición de espera para la pronta transformación en grasas.

Otro sistema de cultivo: el cultivo por lote alimentado haproveído a los experimentadores de una forma de incrementar la densidad celularjunto con el contenido lipídico en las levaduras. Es así como Yamauchi ( 1983)uso etanol como sustrato para la Lypomyces starkeyi y consiguió una densidad debiomasa de 150g L-1 con un contenido de lípidos de 54 %; Rhee ( 1986) alcanzó 185 gramos en base seca de Rhodotorula glutinis por litro con uncontenido de lípidos de 43 % usando glucosa como sustrato de alimentación. Eneste último caso se utilizó aire enriquecido ( 40 % de O2 + 60% deaire) para ser suministrado a las células. Con la densidad anterior un 75 % delvolumen total correspondió a las células . En caso de no usar el " O2enriquecido " la densidad de células es alcanzada con mas variedades delevaduras oleaginosas, aunque existe la contaminación por mohos filamentosos.

Lamentablemente los costos del aire enriquecido,imposibilitarían la implementación comercial; aunque hay que dejar en claroque las más altas tasas de formación de lípidos ocurren en cultivo por lotealimentado, que en los sistemas batch o de cultivo continuo.

Las grasas se extraen en éter de petróleo de la masacelular que ha sido previamente deshidratada y precipitada con etanol o metanol.

De la especie Endomyces Vernalis se extrajeron tambiénpastas untables ricas en proteínas, grasas y vitaminas, en las que la levaduraformaba una gruesa capa rica en grasas, que podían ser procesadas directamentesi el cultivo se realizaba en un recipiente plano( procedimiento en superficie oen "sartén " )

En cuanto a los mohos ,estudios realizados por A.Azeem;Neelagund y Rathod , indican una presencia importantes de ácidos grasospoliinsaturados que pueden ser acumulados en distintas especies como :Aspergillus nidulans, Aspergillus sydowii, Fusarium equisetti, Fusariumoxysporum.

Para comprobar esto se realizó un estudio utilizando unmodificación al medio Czapek – Dox , de modo de maximizar la producción paradichos mohos

 

Mohos

Fuente de Carbono

Nitrógeno

Fuente de Sales minerales

 

Sacarosa %

NH4NO3

NaH2PO4.

2H2O

MgSO4.

7H2O

K2SO4.

6H2O

FeCl3.

7H2O

ZnSO4.

7H2O

pH

A. nidulans

30

0.30

0.730

0.50

0.022

0.016

0.005

6.8

A. sydowi

20

0.30

0.730

0.50

0.022

0.016

0.005

6.8

F.oxysporum

20

0.45

1.098

0.50

0.044

0.016

0.005

6.8

 

 

Urea

 

 

 

 

 

 

F. equisetti

30

0.225

0.730

0.50

0.022

0.016

0.005

6.8

  • Concentración usada para 100 ml de medio

Los esteres de metil que identifican a los distintos ácidos grasos, fueron identificados a través de técnicas cromatográficas

Los datos obtenidos fueron analizados en base a la proporción ( porcentaje ) de ácidos grasos insaturados de los aceites microbianos, comparándolos con los de los otros aceites comestibles.

Microbiano

Cont

Composición ácidos grasos(%)

 

Aceite(SCO)

Grasa

C8

C9

C10

C11

C12

C13

C14

C16

C18

C20

C22

C16:1

C18:1

C18:2

% de

Fuente:

(% w/w)

 

Moho

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ácidos grasos

A. nidulans

50.0

7.7

4.9

7.5

7.4

5.3

14.5

30.8

39.43

(Ri-1.473)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A. sydowii

42.1

1.2

1.4

1.3

1.8

2.4

4.6

3.2

18.6

62.9

64.57

(Ri-1.474)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

F. oxysporum

51.0

0.5

0.3

0.5

1.75

7.6

29.5

52.4

56.61

(Ri-1.470)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

F. equisetti

36.2

0.7

0.5

0.4

1.7

0.6

34.0

46.0

54.82

(Ri-1.471)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Aceite de nuez

12.6

1.7

4.2

2.1

1.4

47.9

29.9

79.35

Aceite dePalma

42.0

4.3

37.9

9.0

50.32

Aceite de coco_

9.2

9.7

44.3

15.9

7.8

2.3

7.8

0.8

8.79

 

Los datos recogidos muestran un porcentaje interesante de lípidos,así como un porcentaje interesante de ácidos saturados como insaturados.

Así podemos decir que del F. Oxysporum el más altoporcentaje de ácidos grasos saturados se encuentran en en los ácidosmiristicos y palmíticos (C14 , C16, respectivamente ); el A. Sydowii no sólocontiene todos los ácidos saturados que produce el moho anterior sino queproduce cantidades importantes de ácidos C11 y C13, además en todos losmicroorganismos se presentó ácido oleico ( 18:1)

Además el perfil de ácidos grasos muestra que el % total enA. nidulans, A. sydowii, F. oxysporum y F.Equisetti es de 78.1 , 97.4, 92.55,83.9 respectivamente. Además de estos respectivos totales el A.nidulans tieneun 60.5% de ácidos saturados y 39.43 % de insaturados que fue la única especieque obtuvo mayor cantidad de ácidos grasos saturados; mientras que las otrasespecies lograron una mayor % de ácidos grasos insaturados.

Con respecto al rendimiento de lípidos logrados ladependencia del medio de cultivo es notable, estudios anteriores en las mismasespecies logran rendimientos de lípidos de 9.3 – 38.7 %.

Además el perfil de ácidos grasos obtenidos por el F.Oxysporum, es similar al aceite comestible de palma; y un cambio de medio asacarosa sólo logra la interconversión entre las cantidades de C16 y C18obtenidas, por lo que aparenta que la síntesis de cadenas largas de ácidosgrasos es la misma.

Además basándonos en la presencia de ácido oleico, losaceites microbianos de A.sydowii y F.oxysporum son similares a los del aceite denuez

Las microalgas son una fuente biológica de lípidos ehidrocarburos, contienen ácidos grasos en los componentes de sus membranas, ensus fuentes de reserva. Los ácidos grasos e hidrocarburos tienen un altopotencial de aplicaciones. Los aceites de las algas tienen composicionessimilares a la de los demás aceites vegetales utilizados, y en el futuro podríanser usados masivamente en alimentación. Los lípidos y ácidos grasoscontenidos en las microalgas varían acuerdo a ciertas condiciones el cultivo,en algunos casos, el contenido lipídico puede ser incrementado por la imposiciónde un régimen austero de nitrógeno, suministrando sólo una pequeña parte desales nutritivas nitrogenadas ( como máximo 1 % del medio de cultivo) u otrosfactores de stress celular. A comienzos de los años 40 los estudios revelabanque , las fracciones lipídicas llegaban a 75 – 80 % de su peso en base seca,lo que supera por mucho a gran cantidad de especies terrestres, por ejemplo elalga verde Chorella pyreneidosa y algunas diatomeas ( por ejemplo Nitzchia spp.) pueden almacenar un máximo de 70 – 80 % y 42 % de su peso seco como grasarespectivamente

Deficiencias de otros nutrientes, además del nitrógeno,podrían ayudar al incremento del contenido lipídico celular, es así como lafalta de silicon por un periodo de 14 horas logró un incremento del 60 % de lípidos.

El cambio de acumulación de carbohidratos a lípidos ocurremuy rápido en las diatomeas, por mecanismos que aún no están bienclarificados

Durante las primeras etapas decrecimiento de los cultivos dealgas, estas producen un alto monto de lípidos polares y ácidos grasospoliinsaturados como C16 y C18 .

En la fase de crecimiento estacionario se presentan ácidosgrasos 18:1 y 16:0. En el caso de las algas verde azuladas, la composición de lípidosy ácidos grasos, muestra sólo pequeños cambios durante el ciclo decrecimiento.

Pero no sólo la nutrición influyen en la composición lipídica,sino que otros factores como la luz incrementan la formación de poliinsaturadosC16 y C18 , así como esfingolípidos y fosfogliceridos enEuglena gracils y Chlorella vulgaris respectivamente. Se ha visto además quelas bajas temperaturas incrementan la síntesis de ácidos grasos polinsaturadosC18 para Monocrysis lutheri y también causa cambios en la composiciónde Dunaliella salina

El contenido de glicerol es también influenciado por lascondiciones del cultivo, particularmente las concentraciones de NaCl, en lafigura se muestra la relación que existe entre la concentración de NaCl, elcrecimiento de la célula y la acumulación de glicerol en Dunaliellatertiolecta. El mayor rendimiento de glicerol se obtuvo cuando la concentraciónde NaCl alcanzó los 2M, mientras que el máximo crecimiento ocurrió cuando seobtuvo la mas baja concentración de NaCl

Fig: Relación entre la concentración de NaCl y laconcentración intra y extracelular de glicerol

Sin embargo todas estas ventajas se ven entrampadasprincipalmente por 2 motivos, la necesidad de dosis ininterrumpidas de luz, asícomo los problemas organolépticos de los aceites obtenidos:

Por calentamiento con luz solar de un cultivo análogo , podríanobtenerse en seis meses con algas anteriormente nombradas, sobre una superficiede 500 m2, aproximadamente 100 kg de grasa. En cambio con un cultivode colza se obtuvieron 24 – 50 kg . Pero debido a su sabor poco agradable nopuede utilizarse la grasa bruta de las algas en la alimentación y por otraparte es muy costosa su purificación en comparación con la utilizacióndirecta de las grasas vegetales. Aunque su empleo sería posible en situacionescríticas de abastecimiento como ocurrió en la segunda guerra mundial.

El principal foco de los investigadores, debido a lanecesidad de renovar las fuentes de energía fósiles y que sean lo menoscontaminantes posibles es la de obtener biocombustibles.

Anexo: Cultivo a escala laboratorio de algas

La microalga verde Dunaliella tertiolecta ATCC 30929 fuecultivada en un medio con la siguiente composición: NaCl 58.5g; MgCl26H2O1.5g; KNO3 1.0 g; MgSO4 7H2O 0.5 g;KCl 0.2g; CaCl2 2H2O 0.2 g; NaHCO343mg; KH2PO4, 40.8 mg; K2HPO4 0.495g; FeCl3 solucion 1.0 ml; metalica solucion 1.0 ml. La FeCl3solucion consistió en (por litro): FeCl3 0.03 g; EDTA 2Na5.84 g. La metalica solucion consistió en (por litro): H3BO40.61 g; MnCl2 4H2O 23mg; ZnSO4 7H2O87mg; CuSO4 7H2O 0.06 g; (NH4)6Mo7O244H2O 21mg; CoCl2 5H2O 15mg;EDTA 2Na 1.89g. El cultivo maestro es depositado en 3 L de medio a 27°C,usando un fermentador de 5 litros (Fig. 6-3). La tasa de aireación y la rapidezde agitación fue mantenida constante a 1 vvm y 200 rpm, respectivamente. gasfue producido por mezcla de CO2 con aire a una razón fija entre 0 y0.1 y lámparas fluorescentes son usadas para la irradiación externa delfermentador; el grado de irradiación que llega al recipiente del fermentador esde 10,000 1x.

Fig: Aparato fermentador de 5 Litros utilizado en el cultivode microalgas

Fig: Efecto de la intensidad de la luz en un fermentador demicroalgas de 5L

La figura muestra que el crecimiento celular se vedeterminado por la intensidad de la luz, obteniéndose crecimiento de prácticamente el doble cuando la intensidad de la luz es el doble ( 100000 a 5000 lx )

Con respecto CO2, el crecimiento celular normalesdentro el fermentador ocurre a concentraciones de 3 a 10 %, no obstante elcrecimiento limitado ocurre a concentraciones muy bajas alrededor de 0.03 % deCO2

Fig: Concentración celular con diferentes concentraciones deCO2

Anexo: Fotografías de microorganismosproductores de lípidos

Fig:Chlorella pyreneidosa Fig:Endomyces vernalis Fig: Nitzchiaspp

CONCLUSIONES

     

  • Dentro de los microorganismos aquellos que tienen mayoresoportunidades de desarrollo están principalmente los hongos en general ( mohosy levaduras ) y le siguen las algas, muy por detrás están las bacterias queacumulan una menor cantidad de lípidos
  • Las algas a pesar de poder contener un porcentaje alto de su peso en lípidos, sufren el problema de ser dependientes de la luminosidad para lograr primero su crecimiento y luego la concentración de material lípidico en su interior, por lo que su cultivo si es a gran escala, debe ser en zonas de alta incidencia de luz solar, además cuentan con la desventaja de un sabor poco agradable, que requiere de procesos de refinación, que encarecerían el costo
  • El mecanismo por el cual se producen la acumulación de lípidos es el mismo en bacterias y hongos: las celulas se ven enfrentadas a una falta de nitrogeno en su medio y/ o otros nutrientes, mientras la disponibilidad de carbohidratos supera sus requerimientos, de esta manera la celula ya no puede sintetizar proteinas y por lo tanto deja de multiplicarse; su metabolismo cambia y de producir reservas de energía del tipo carbohidrato pasa a crear material de reserva lipídico.
  • La producción de lípidos y ácidos grasos por la biotecnología es una rama incipiente, que todavía necesita de modificaciones de modo de poder competir comercialmente con la producción obtenida de las especies vegetales.
  • La producción de lípidos microbianos, de ser comercializada hoy día sólo puede ser un complemento de las distintas alternativas que hoy se presentan en el mercado, a través de su parecido ( por composición de ácidos grasos, porcentajes de estos dentro del material lipídico), a muchos aceites vegetales, ejemplo aceite de nuez, palma,etc.

BIBLIOGRAFÍA

     

  • Jagnow C. Dawid D. (1991 ) ; Biotecnología, Introducción conexperimentos modelo; Ed Acribia S.A ; p: 67 – 70
  • Monckeberg. F (1988 ) ; La Revolución de la Bioingeniería; Publicaciones Técnicas Mediterráneo ; p: 63-67
  • Abdul Azeem, Neelagund YF, Vandana Rathod (1993) Production of fat from fungi:Influence of temperature. Bull Pure & Appl Sci 128(1–2) p: 31–35.
  • Rattan Chand, Srinivasan RA (1984) Lipid and phospholipid synthesis by Fusarium sps.N-9, Part III: Influence of temperature and pH on the production of fat in the cells of Fusarium sps. Indian J Dairy Sci 37(4)p: 389–392.
  • Boletín Informativo FAO 2000; Oil Products
  • Colin Ratledge; Microbial Lipids; p: 135-142
  • A Azeem, Y.F. Neelagud_ and V. Rathod (1999);Biotechnological production of oil: Fatty acid composition of microbial oil Plant Foods for Human Nutrition 53: 381–386.

 

Autor:
Sebastián Acuña Verrugio

tspstiga@hotmail.com

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