Este novel estudio del tratamiento de las masas tumorales se basa en la capacidad de las células tumorales de absorber in vivo partículas absorbentes de energía detectables por resonancia magnética y la posibilidad de destruirlas selectivamente con pulsos de láser con mínimos efectos secundarios sobre las células normales adyacentes.
    La idea principal de este tipo de aproximación diagnóstico-terapéutica es la del uso como coadyudantes del neurocirujano, quien luego de la resección de la masa tumoral, coloca al paciente dentro de un resonador de tipo abierto para observar primero el área todavía no resectada (observable gracias a la presencia del agente de contraste) y la posterior irradiación de la zona con la consiguiente destrucción de los focos satélites localizados en la periferia del tumor en áreas de tejido cerebral normal , con función cerebral todavía conservada.
    En esta presentación enfocaremos en el tratamiento de los tumores cerebrales debido a que el tratamiento mínimamente invasivo es altamente deseado en patologías de este tipo (en las que la conservación del máximo de función cerebral normal adyacente al tumor es vital) aunque el método también puede ser utilizado en otros tumores o tejidos no tumorales. Los tumores del sistema nervioso central representan aproximadamente un 2-5 % de todos los tumores. Un 80% se localizan a nivel del cerebro de los cuales un 50% son gliomas. A pesar del desarrollo de la radio- y quimioterapia como coadyudantes de la cirugía el pronóstico general es sombrío.
    Los óxidos de hierro también denominados MION (monocrystalline iron oxides nanoparticles) fueron originalmente desarrollados como agentes de contraste para resonancia magnética en el Center for Molecular Imaging Research del Massachusetts General Hospital bajo la dirección del Dr. Ralph Weissleder (1). Por medio de estudios posteriores se descubrió que pueden ser potencialmente utilizadas tanto para fines diagnósticos como terapéuticos.
    Estas partículas consisten en un cuerpo central monocristalino formado por 2.000 átomos de Fe de 4 nn de diámetro al cual se anclan múltiples moléculas de dextrano lo que les otorga un peso molecular de aproximadamente 11.000 (ver figura 1). Estas moléculas de dextrano que rodean a la superficie del compuesto aumentan el radio hidrodinámico del compuesto hasta 25 nn. Estudios in vivo realizados en el pasado han demostrado que el MION pueden penetrar a través del endotelio capilar y localizarse en las células tumorales por medio del proceso de endocitosis de fase fluida (2). El estudio de la distribución intratumoral del compuesto en un modelo murino de gliosarcoma demostró que la relación de distribución entre células de tejido normal y tumoral es de 10 a 1 con un valor absoluto de 0,1 % de la dosis inyectada por gramo de tejido tumoral (3,7). En el interior del tumor, aproximadamente una mitad (49%) se localiza en las células tumorales, 21 % en los macrófagos y un 6.5% en las células endoteliales (3).
    Por medio de estudios realizados en nuestro laboratorio para alcanzar una mayor concentración de átomos de hierro en el interior celular (necesaria para alcanzar una tasa de letalidad suficientemente importante) se observó que la modificación de la molécula de MION con la incorporación de un péptido (portador de una señal de translocación de membrana) derivado del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) (denominado por nuestro laboratorio como CLIO-TAT) lleva al incremento de 100 veces en la capacidad de internalización del compuesto a linfocitos murinos y células de gliosacoma murino (4).
    Estudios paralelos realizados por los Wellman Laboratories of Photomedicine también del Massachusetts general Hospital (5) han demostrado que las células pigmentadas del cuerpo pueden ser selectivamente aniquiladas por medio de pulsos cortos de láser tanto in vitro como in vivo (esta técnica está siendo actualmente utilizada para el tratamiento de enfermedades de la piel, nevos pigmentadas así como también para la remoción de pelos y tatuajes (6)) .Con la excepción de los tatuajes, este procedimiento se basa en la deposición de energía a través del láser a pigmentos intrínsecos absorbentes de luz como la hemoglobina y la melanina. Nuestra aproximación a la ablación selectiva de tumores se basa sobre esta técnica por medio del uso del CLIO-TAT como nanopartícula pigmentada extrínseca (aunque internalizada) absorbente de luz en lugar del uso de las partículas intrínsecas antes mencionadas.. El mecanismo básico de la interacción partícula-luz y la destrucción celular inducida por láser han sido recientemente dilucidados (6): consiste en el calentamiento transitorio rápido de las partículas pigmentadas intracelulares que produce la evaporación de las moléculas de agua ubicadas a su alrededor ocasionando una explosión denominada microcavitación (6) con la consecuente muerte de las células que contienen las partículas sin efecto sobre las células adyacentes que no las contienen (6)

Experimentos in vitro
    Para estudiar la factibilidad de la destrucción selectiva de células tumorales, células de glioma murino 9L fueron incubadas in vitro durante una hora a distintas concentraciones (5, 25, 50 y 100 µg [Fe] ) de CLIO-TAT para permitir la incorporación del compuesto. Previo a la irradiación, las células fueron transferidas a un medio de cultivo libre del compuesto y calceína fluorescente fue adicionada para marcar las células viables (la presencia de fluorescencia en el interior de las células es sinónimo de viabilidad celular, ver figura 2). El cultivo fue posteriormente irradiado con pulsos de láser de 20 ns en el espectro de los 523 nm (a razón de 10-100 pulsos por campo; fluencia: 0.5 J/cm²). El procedimiento fue realizado en un microscopio con iluminación estroboscópica para observar la microcavitación inducida por los pulsos de láser (ver figura 3). El porcentaje de letalidad in vitro fue de alrededor del 100% inmediatamente después del procedimiento. (en procedimientos paralelos 0% de las células no marcadas fueron destruidas)

Experimentos in vivo
    Ratas Fischer 344 fueron utilizadas para demostrar la factibilidad de su visualización por resonancia magnética (ver figura 4). Los animales fueron inmovilizados en un cuadro estereotáctico, anestesiados e implantados con una suspensión de células de gliosarcoma murino 9L a nivel del caudo-putamen. Un set de ratas fueron inyectadas con CLIO-TAT marcado con Indio 111 para realizar estudios de biodistribución del compuesto; de estos resultados se dedujo que la relación entre tejido tumoral y tejido cerebral normal era de 10 a 1 lo que es importante en la selectividad que se necesita alcanzar.
    Paralelamente un grupo de ratas fueron implantadas intracerebralmente con células marcadas con CLIO-TAT previa irradiación para demostrar la no viabilidad de las mismas gracias a la acción de los pulsos de láser.

Discusión
    La modificación del MION con la incorporación del péptido Tat derivado del VIH permite una incremento suficiente en la concentración de átomos de hierro necesarios para lograr la inducción de microcavitación en el interior de la célula tumoral. La incorporación del compuesto a células endoteliales (debido a la propiedad del MION de ser incorporado a las células en rápida proliferación) es un punto que debe ser más ampliamente estudiado para lograr una mayor selectividad.
    Con estos estudios de factibilidad efectuados hasta el momento es evidente que este tipo de aproximación a la destrucción selectiva de los tumores es un área que debe ser estudiada más ampliamente.
    La deposición de energía a las células es un método cada vez más comúnmente utilizado para la destrucción de células. Actualmente, diversas terapias tales como la terapia fotodinámica están siendo estudiadas en laboratorios y ensayos clínicos como complemento de la resección quirúrgica y/o radio / quimioterapia de las neoplasias intracraneales. Comparado con la terapia fotodinámica, este método produce destrucción celular mediante interacciones mecánicas y térmicas en lugar de la producción de reacciones químicas especiales (formación de radicales libres) por lo que no es afectada por la hipoxia tisular la cual es una de las mayores limitaciones de la terapia fotodinámica. Este método es también diferente de la hipertermia convencional con láser (utilizada actualmente) que usa pulsos largos o continuos y que se basa en la conducción de calor para la destrucción de las masas tumorales.
 
 

Figura 1. Estructura molecular del MION. Véase el núcleo central formado por átomos de hierro rodeado de una capa de dextranos.

Figura 2. Linfocitos (células de forma redonda) y célula de gliosarcoma murino 9L (irregular) con CLIO-TAT en su interior, observadas bajo microscopio de fluorescencia. Obsérvese la destrucción después de la irradiación con pulsos de láser (antes, izquierda: después, derecha)
 
 

Figura 3. Imagen estrosboscópica típica de una célula de gliosarcoma murino 9L marcada con MION-In111 modificado (A) antes, (B) 45 nanosegundos después del pulso de láser y (C) después del colapso de la microcavitación.

Figura 4. Resonancia magnética de tumor intracerebral de gliosarcoma murino 9L antes (izquierda) y 24 hrs después (derecha) de la inyección intravenosa de CLIO-TAT.
 

BIBLIOGRAFIA
1.Weissleder R, Papisov M. Pharmaceutical iron oxides for MR imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging, 1992;4: 1-20
2.Moore A, Weissleder R, Bogdanov A. Uptake of dextran-coated monocrystalline iron oxides in tumor cells and macrophages. JMRI, 1997; 7:1140-1145
3.   A Moore, E Marecos, R Weissleder, A Bogdanov, Jr.  Macro and microscopic tumoral distribution of long circulating iron oxide nanoparticles.  Radiology 214 (2): 568-574, Feb 2000.
4. Bhorade R, Weissleder R, Nakakoshi T, Moore A, Tung CH. Macrocyclic chelators with paramagnetic cations are internalized into mammalian cells via a HIV-Tat derived membrane translocation peptide. Bioconjugate Chemistry, 2000;11:301-305
5.   Anderson RR, Parrish JA, Selective photothermolysis, Science 220:524 (1983).
6.  Lin CP, Kelly MW.  Cavitation and acoustic emission around laser-heated microparticles.  Appl. Phys. Lett, 72:2800 (1998).
7. Moore A, Weissleder R, Bogdanov A Jr, Uptake of dextran-coated monocrystalline iron oxides in tumor cells and macrophages.  J Magn Reson Imaging 7:1140-5 (1997).
8. Intracellular magnetic labeling of lymphocytes for in vivo trafficking studies. U Schoepf, E Marecos, R Melder, RK Jain, and R Weissleder. BioTechniques. 24 (4): 642-651, Apr 1998.