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Microscopía confocal
2.
Factores que influyen en la obtención de una buena
imagen 3.
Usos 4.
Fluorocromos El
Microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas: -
un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del
fotodetector, denominado Pinhole de Emisión
Manuel
Reina , Univ. deBarcelona
(http://www.ub.es/biocel/wbc/images/fluorescencia/clsm.jpg)
-
Alta precisión y velocidad en el barrido -
Pinhole continuamente variable -
Resolución hasta los 2048 x 2048 pixeles -
Controles independientes del PMT, amplificadores, filtros y
configuraciones. -
Un detector y un pinhole por canal -
Un filtro optoacústico para el control de cada láser -
Disminución del ruido -
Escaneos seriados para la realización del objeto en 3D -
expresión y localización de moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo
reconstrucciones tridimensionales, tanto en cultivos celulares como tejidos
histológicos; -
estudios de colocalización de proteínas u otro tipo de moléculas; -
transporte intracelular, endocitosis; -
medidas de concentraciones de iones intracelulares; -
desarrollo y expresión génica; -
hibridación in situ con sondas fluorescentes; Los
fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una
longitud de onda determinada cuando captan (son exitados) por un fotón
incidente de una longitud de onda característica. Uno
de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de
fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz
empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante
largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia
('fluorescence fading'). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este
efecto, entre ellos destacan : ·
el uso de reactivos
protectores de la fluorescencia ('antifading reagents') ·
el uso de fluorocromos con
poco 'fading' ·
el empleo de luz de excitación
de menor intensidad ·
la reducción de la
concentración de oxígeno en el especimen ·
el direccionamiento del 100%
de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,...) para reducir
al máximo el tiempo de exposición. ·
el empleo de mecanismos de
medición de la exposición óptima (automática) para reducir la iluminación
al máximo. Los
reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos
electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas
donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha
vecindad a las moléculas de fluorocromo. Los
reactivos antifading más empleados son los siguientes : ·
p-phenylenediamine. Es el
reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la fluoresceína
(FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en
la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso. ·
DABCO
(1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque
menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico.
·
n-propyl galeate. Es el agente
más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína.
Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. ·
2-mercaptoethylamine. Se
emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñinas con ioduro
de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se
emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA. ·
Colorantes
más utilizados – Rangos de emisión:
MARIANA
PUCCIARELLI Estudiante
de Farmacia Buenos
Aires - Argentina
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