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Parámetros Cinéticos de la degradación del ciclohexano por dos bacterias del género Bacillus

Resumen: La contaminación del ambiente marino por hidrocarburos del petróleo, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos de Cuba, cuenta con el bioproducto BIOIL-FC para combatir los derrames de petróleo. Palabras Claves: Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis, ciclohexano, velocidad específica de crecimiento máxima, constante de afinidad, constante de inhibición, modelo de inhibición.
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Autor: Yoania Cabranes Campos y Otros Autores

RESUMEN

La contaminación del ambiente marino por hidrocarburos del petróleo, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos de Cuba, cuenta con el bioproducto BIOIL-FC para combatir los derrames de petróleo. Este bioproducto ha sido utilizado en numerosos derrames ocurridos en nuestro país con resultados satisfactorios. El BIOIL-FC está formado por cinco bacterias degradadoras de hidrocarburos, dentro de las que se encuentran Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60. El presente trabajo está dirigido a determinar y comparar los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60 en ciclohexano mediante el conteo en cámara de Neubauer y el método de Lineweaver-Burk, así como definir los nuevos modelos de inhibición del crecimiento. La cepa CBM-225 presentó menor velocidad específica de crecimiento   máxima, mayor afinidad y menos inhibición de su crecimiento por el ciclohexano con respecto a la cepa CBM-60. Fueron determinados nuevos modelos de inhibición para ambas cepas.

Palabras Claves: Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis, ciclohexano, velocidad específica de crecimiento máxima, constante de afinidad, constante de inhibición, modelo de inhibición.

Abstract

The marine environment contamination by hydrocarbons of the petroleum is very alarming for the disastrous damages that it causes. The Applied Microbiology department of the Marine Bioproducts Center of Cuba, has formulated the bioproduct BIOIL-FC to combat the oil spills. This bioproduct has been used in numerous spills happened in our country with satisfactory results. The BIOIL-FC is formed by five degradadors bacterias of hydrocarbons, such as Bacillus alcalophilus CBM-225 strain and Bacillus licheniformis CBM-60 strain. The present work had been developed to determine and to compare the growth kinetic parameters of the CBM-225 and CBM-60 strain in cyclohexane for the count in Neubauer camera and Lineweaver-Burk method, as well as to define the new  growth inhibition models. The CBM-225 strain presented smaller specific speed of growth maxim and inhibition of its growth and bigger affinity by cyclohexane respect CBM-60 strain. Inhibition models new were determined for both strain.

Key words: Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis, cyclohexane, specific speed of growth maxim, affinity constant, inhibition constant, inhibition model.

INTRODUCCIóN

La contaminación ambiental por hidrocarburos del petróleo y en particular del ambiente marino, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El océano constituye un ecosistema muy dinámico y complejo, que el hombre está destruyendo con contaminantes químicos, entre ellos el petróleo y sus derivados, llegando a comprometer la red alimentaria del medio marino (Margesin y Schinner, 2001).

Los efectos biológicos de un producto petrolífero, aunque de difícil predicción, pueden ser muy graves, al actuar a todos los niveles de organización biológicas, desde los componentes subcelulares hasta los niveles superiores del ecosistema de tal forma que miles de especies marinas de diversa naturaleza han desaparecido a causa de estos grandes accidentes (Mac Rae, 1998).

La posición geográfica del archipiélago cubano y el tráfico marítimo en torno al mismo, así como la creciente explotación y perforación de pozos de petróleo en nuestra plataforma, aumentan considerablemente la posible contaminación de las costas.

El departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR) perteneciente al Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente de Cuba, trabaja en el aislamiento y conservación de bacterias marinas que sean capaces de degradar hidrocarburos del petróleo. Este departamento cuenta con un gran número de bacterias que utilizan los hidrocarburos como única fuente de carbono y energía (1994; Núñez, 2003; Ortiz, 2004) y que forman parte de su Colección de Bacterias Marinas (CBM).

A partir de una selección de estas cepas se han obtenidos diferentes productos, tales como el CBM-225, cultivo mixto A-5, BIOIL y BIOIL-FC, utilizados en numerosos tratamientos a derrames de petróleo ocurridos en nuestro país con porcentaje de remoción de los hidrocarburos entre un 70 y un 90% a los 28 días de empleados (Núñez, 2003). 

En los tres últimos bioproductos prevalece la presencia de Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 como las cepas más importantes de estos bioproductos. La cepa CBM-225, pues se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución que es la responsable de un alto porcentaje de la actividad del bioproducto en los derrames de petróleo (Joseph, 1996) y la cepa CBM-60, ya que además de pertenecer al mismo género la cepa CBM-225, produce tensioactivos en sustratos hidrosolubles (Ortiz, 2004).

Además, nuestro departamento ha realizado análisis fisiológicos, bioquímicos y cinéticos de los procesos  degradativos de varios hidrocarburos del petróleo cubano, entre ellos el ciclohexano, llevados a cabo por ambas cepas Núñez, 2003). Ha resultado novedoso la capacidad de éstas de degradar dicho hidrocarburo como única fuente de carbono y energía, si se tiene en cuenta que algunos autores plantean que el mecanismo de bioxidación de los cicloalcanos debe ser similar al de los isoalcanos, mediante un proceso de cometabolismo o cooxidación en presencia de otros alcanos (Martinkova y cols., 1985; Murakami y cols., 1985; Jitnuyanont y cols., 2001).

Este trabajo se desarrolló con el objetivo de determinar los parámetros cinéticos del crecimiento de Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 en presencia del ciclohexano.

Materiales y Métodos

Microorganismos empleados

El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 (Núñez, 2003) y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 (Ortiz y cols., 2002) aisladas de los sedimentos de la plataforma cubana en la bahía de Cárdenas, Matanzas perteneciente a la CBM del CEBIMAR.

Medios de Cultivo

Para la conservación de las cepas CBM-225 y cepa CBM-60 se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según Gorbienko (1961), la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana de la cepa CBM-225 se realizó según Núñez (2003) y para la cepa CBM-60 se llevó a cabo según Ortiz (2004).

Condiciones de cultivo en zaranda

Con el preinoculo obtenido a partir del medio de obtención de biomasa (Núñez, 2003; Ortiz, 2004) se inocularon frascos Erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 50 mL de medio de degradación de hidrocarburos (Núñez, 2003) a una concentración inicial de microorganismos de 106 celmL-1. Todos los experimentos fueron desarrollados a escala de zaranda orbital rotatoria Infors a 125 r.min-1 y 30 ºC.

Los medios de degradación de hidrocarburos contenían concentraciones de ciclohexano (Panreac, 99,8 % de pureza) de 5, 10, 20, 30 y 40 gL-1, de los cuales fueron tomadas muestras cada cuatro horas.

Crecimiento microbiano en medio de degradación de hidrocarburos

La determinación del crecimiento microbiano en el medio de degradación de hidrocarburos se realizó mediante el conteo total de células en cámara de Neubauer (Martínez y cols., 1989).

Velocidad específica de crecimiento (µ)

La µ fue determinada en la fase exponencial del crecimiento, mediante el modelo de crecimiento no restringido (López y Gódia, 1998).

Determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60

Para cada una de las concentraciones de sustrato fue calculada en la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60. A partir de ellas fueron estimados los valores de velocidad específica de crecimiento máxima (µmax) y de la constante de disociación o constante de afinidad (Ks) mediante la transformación lineal de Lineweaver-Burk (Chávez y cols., 1990). Además, fue determinada la constante de inhibición (Ki) de ambas cepas con ciclohexano según la expresión de Andrews linealizada (Chávez y cols., 1909; Boyer, 1999).

Determinación del modelo cinético de las cepas CBM-225 y CBM-60

Para la determinación de los nuevos modelos cinéticos en la zona de inhibición del crecimiento de ambas cepas, fue realizada una modificación de la ecuación de Andrews, donde el término a corresponde al coeficiente de inhibición:

A partir del ploteo del ln a vs ln S fueron determinados los valores de n, m y Ki, para luego obtener los valores de a, Ki y el modelo cinético de inhibición.

Los datos experimentales de µ, el valor de µmax y Ks obtenidos por el método de Lineweaver-Burk y el valor de Ki obtenido por este método, fueron evaluados en la expresión del modelo cinético para analizar si presenta el mismo comportamiento que los datos experimentales.

Tratamiento estadístico de los resultados

En todos los casos una vez que fue verificado el cumplimiento de la distribución normal de los datos según Kolmogorov Smirnov y la homogeneidad de varianzas por el método de Bartlett, se realizó el análisis de varianza de clasificación simple (Lerch, 1977) y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan (Duncan, 1965). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Todos los resultados fueron procesados con el paquete estadístico Statistica 4.0 y/o Excel 7.0 para Windows.

RESULTADOS

Influencia de la concentración de ciclohexano en la velocidad específica de crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60

En la figura 1 se muestra el comportamiento de los valores de µ para las cepas CBM-225 y CBM-60 obtenidos experimentalmente y los valores de µ determinados por el modelo de Monod en relación a la concentración de ciclohexano y la dependencia del inverso del valor de µ con respecto al inverso de la concentración de dicho sustrato.

Figura 1. Comportamiento dinámico de los valores de µ experimentales y los valores de µ calculados por el modelo de Monod (A:CBM-225;C:CBM-60) y curva de inhibición del crecimiento (B:CBM-225;D:CBM-60) con respecto a la concentración de ciclohexano en el medio de degradación a 30 oC y 125 rmin-1.

El comportamiento de la velocidad específica del crecimiento obtenida experimentalmente para la cepas CBM-225 y CBM-60 con concentraciones de ciclohexano entre cero y 30 gL-1 (figura 1A y C), representan dos zonas bien delimitadas. A valores entre cero y 20 gL-1 la dependencia del valor de µ con la concentración de ciclohexano fue prácticamente lineal hasta valores de 0,100 h-1 (CBM-225) y 0,137 h-1 (CBM-60). Estas etapas corresponden con las zonas de no inhibición del crecimiento de los microorganismos de un inverso de concentración de ciclohexano de 0,200 Lg-1 (5 gL-1) a 0,050 Lg-1 (20 gL-1) que concuerda con el modelo de Monod (figura 1 B y D).

Los valores de µ entre 15 y 22 gL-1 de concentración de ciclohexano disminuyen los valores de µ, no siendo las diferencias entre estos valores estadísticamente significativos mostrado con la misma letra (figura 1 A y C). Por tanto, la zona de no inhibición del crecimiento de los microorganismos está representada desde cero hasta los 22 gL-1 de concentración de dicho hidrocarburo.

A partir de un inverso de concentración del hidrocarburo de 0,043 Lg-1 (23 gL-1) a 0,033 Lg-1 (30 gL-1), se observa la zona de inhibición por exceso de ciclohexano (figura 1 B y D), la cual concuerda con la disminución estadísticamente significativa del valor de µ entre 0,091 y 0,041 h-1 para la cepa CBM-225 (figura 1A) y entre 0,137 y 0,031 h-1 para la cepa CBM-60 (figura 1C) y muestra una desviación del modelo de Monod.

Los parámetros cinéticos de umax, Ks y Ki determinados fueron para la cepa CBM-225 de 0,117 ± 0,003 h-1,  4,712 ± 0,264 gL-1 y 13,011 ±  0,662 gL-1 y para la cepa CBM-60 de 0,229 ± 0,092 h-1, 13,290 ± 0,092 gL-1 y 17,391 ± 0,550 gL-1 respectivamente.

Al evaluar los parámetros cinéticos en la expresión que representa el modelo de Monod para la zona de no inhibición y de inhibición por exceso de sustrato  (figura 1 A y C), se comprobó que dicho modelo se ajustó a los datos experimentales en la zona de no inhibición entre cero y 22 gL-1 de concentración de ciclohexano, sin haber diferencias estadísticamente significativas.

En la zona de inhibición del crecimiento de ambas cepas, el modelo de Monod al igual que los modelos de inhibición por exceso de sustrato encontrados en la literatura de Yano, Webb, Aiba y Teissier (Edwards, 1970; Harder y Roels, 1982; Stryer, 1995), no se ajustó a los datos experimentales para esta cepa, por lo tanto los valores de Ki obtenidos anteriormente son valores aparentes.

Por tal razón, se determinaron los nuevos modelos que permitieron calcular los valores de las constantes de inhibición reales en la zona de 23 a 30 gL-1 de concentración de ciclohexano con sus respectivos coeficientes de determinación:

Los parámetros cinéticos reales fueron evaluados en los nuevos modelos. Los comportamientos de los valores de µ teórica y la concentración de ciclohexano para estas cepas se muestran en la figura 2.

Figura 2. Comparación del comportamiento dinámico de los valores de µ experimentales y los valores de µ determinados según los nuevos modelos del crecimiento de las cepas CBM-225 (A) y CBM-60 (B) con respecto a la concentración de ciclohexano en el medio de degradación a 30 oC y 125 r.min-1.

 Los valores de las µ teóricas calculadas por los modelos en las zonas de inhibición del crecimiento para dichas cepas no presentaron diferencias significativas con los valores de las µ experimentales (figura 2), de esta forma los modelos propuestos ajustaron matemáticamente con los datos experimentales obtenidos. Además, teniendo en cuenta los valores de las constantes de inhibición reales determinados, se refleja que los valores de Ki aparente calculados por el modelo de inhibición de Monod, estaban sobrestimadas.

Los parámetros cinéticos obtenidos por el método de Lineweaver-Burk en la zona de no inhibición para las cepas CBM-225 y CBM-60 se muestran en la tabla I.

Tabla I. Parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60 utilizando ciclohexano.

 cepas

µmax (h-1)

Ks (gL-1)

Ki real (gL-1)

CBM-225

0,117b ± 0,164

4,712b ± 0,164

1,426x10-13 a ± 1,242x10-12

CBM-60

0,229a ± 0,092

13,290a ± 0,092

2,420x10-14 b ± 4,532x10-13

 Los resultados estadísticos de análisis de varianza de clasificación simple y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan (Lerch, 1977), arrojaron que existen diferencias significativas entre las velocidades específicas de crecimiento máximas, las constantes de disociación y las constantes de inhibición de las cepas CBM-225 y CBM-60 representado por diferentes letras.

DISCUSIÓN

Para evaluar la persistencia de contaminantes orgánicos y estimar su efecto en el ecosistema es necesario conocer la cinética de biodegradación, la cual definirá la concentración del compuesto químico remanente en un tiempo dado y permitirá estimar la eliminación del mismo (Fahr, 1999).

La cepa CBM-60 presentó un mayor valor de velocidad específica de crecimiento y de Ks, o sea una menor afinidad, que la cepa CBM-225 (tabla I), lo que significa que la cepa CBM-60 requiere de una concentración más alta del hidrocarburo para llegar a la mitad del valor de la µmax en comparación con la cepa CBM-225.

Al ser el ciclohexano un compuesto cíclico, la ruptura del ciclo por la acción de enzimas mono o di-oxigenasas es el primero paso y determinante del proceso de degradación de este tipo de hidrocarburo para ambas cepas (Corniglia, 1980; MacRae y Hall, 1998; Margesin y Schinner; 2001; Yerushalmi, 2001). La cepa CBM-225, al tener mayor afinidad por el sustrato, rompe el ciclo más rápido siendo este paso menos lento. Sin embargo, la cepa CBM-60 requiere más concentración de sustrato para alcanzar la mitad de su valor de velocidad específica de crecimiento máxima, lo que puede estar dado a que le resulte más difícil romper el ciclo y de esta forma, el paso determinante es más lento.

Además, existe la posibilidad de que el proceso de ruptura del anillo, se lleve a cabo por enzimas que alcanzan su mayor actividad a altas concentraciones de ciclohexano o que sea una enzima inducible, la cual necesita determinada cantidad del hidrocarburo para que se induzca su síntesis y llevar a cabo la ruptura del anillo. Este proceso pudiera ser más lento para la cepa CBM-60, por necesitar mayor concentración del hidrocarburo que la cepa CBM-225.

Una vez roto el anillo, se desencadena el proceso de degradación por la cepa CBM-60, alcanzando mayor µ a la misma concentración de ciclohexano que la cepa CBM-225 (figura 1 C y A respectivamente), ya que la primera cepa es capaz de asimilar mejor la energía que obtiene del hidrocarburo.

También la cepa CBM-225, pudiera ser más sensible a la inhibición que pudieran ocasionar los intermediarios de la degradación del ciclohexano a nivel del transporte de este hidrocarburo y demás intermediaros al interior del microorganismo y a nivel de los procesos metabólicos y degradativos fundamentales. Esto implicaría que esta cepa presente menor valor de velocidad específica de crecimiento.

Los resultados anteriores (figuras 1 y 2), apoyados por los estudios fisiológicos y cinéticos de los procesos  degradativos de estas cepas en presencia del ciclohexano (Núñez, 2003), demostraron que las cepas CBM-225 y CBM-60, fueron capaces de degradar el ciclohexano, hidrocarburo cíclico, como única fuente de carbono y energía para su crecimiento celular. Dicha degradación se llevó a cabo sin necesidad de recurrir a un proceso de cometabolismo, en el cual se hace necesaria la presencia de un hidrocarburo alifático, como plantearon Martinkova y cols. (1985) y Murakami y cols. (1985), lo cual resulta novedoso.

El comportamiento cinético mostrado por las cepas CBM-225 y CBM-60 utilizando ciclohexano, es típico de otras cepas Bacillus de origen marino en sustratos hidrosolubles como la sacarosa, con la producción de sustancias mucoides (Castro, 1997; Romeu, 2001; Núñez, 2003).

La ecuación de Monod sólo es válida bajo condiciones de crecimiento balanceado. Generalmente se considera que el crecimiento exponencial en cultivos batch y el estado estacionario en cultivos continuos, son las únicas situaciones donde se presenta el crecimiento balanceado.

Como se observó en las figuras 1 y 2, hubo una primera etapa concordante con una cinética clásica de Monod y una segunda etapa, que no se relacionó con dicho modelo. En los sistemas cerrados la fase exponencial del crecimiento no puede desarrollarse indefinidamente, debido a que la actividad metabólica de los microorganismos disminuye la concentración de sustrato. Así disminuye la velocidad de los procesos enzimáticos del metabolismo celular y por ende disminuye la velocidad de crecimiento del microorganismo.

Los valores de las constantes de inhibición reales para los modelos determinados en la zona de inhibición de las cepas CBM-225 y CBM-60 consumiendo ciclohexano (tabla I), fueron menores que los valores aparentes obtenidos por el modelo de inhibición de Monod. Esto evidenció una marcada inhibición del crecimiento del microorganismo por el exceso del sustrato, ya que los valores de Ki reales obtenidos fueron muy pequeños, siendo muy grande el valor de concentración del complejo inactivo sustrato-microorganismo-sustrato o sustrato-enzima-sustrato, lo cual se deduce de la expresión de Ki en la inhibición incompetitiva que viene dada por el cociente del producto de la concentración enzima-sustrato por la concentración del sustrato entre la concentración del complejo sustrato-enzima-sustrato (Chávez y cols., 1990; Boyer, 1999).

Dichos valores de Ki para ambas cepas fueron diferentes estadísticamente (tabla I). El crecimiento de la cepa CBM-60 resultó más inhibido por el ciclohexano que el de la cepa CBM-225, al presentar la primera menor valor de su constante de inhibición, lo que significa que se inhibe a concentraciones de sustrato más pequeñas.

También fue de notar como en la zona de inhibición, los valores de µmax aparente (µmax real/a) y Ks aparente (Ks real/a) disminuyeron con respecto a los valores reales (tabla I), al estar afectados por el factor de inhibición a. Esto corroboró que nos encontrábamos en presencia de una inhibición del tipo incompetitiva, donde disminuyen tanto los valores de velocidad específica de crecimiento máxima aparente, como los de la constante de disociación aparente en la zona de inhibición por exceso de sustrato (Chávez y cols., 1990; Boyer, 1999).

La explicación fisiológica y bioquímica de los resultados obtenidos en la segunda etapa del crecimiento de estas cepas (figura 1), pudiera estar asociada a la presencia o acumulación de algunos productos metabólicos, así como de algún intermediario de la degradación de este sustrato, que sea tóxico al microorganismo e inhiba enzimas claves de las rutas metabólicas centrales del crecimiento, degradación y transporte al interior celular del hidrocarburo y en consecuencia, disminuya la velocidad de crecimiento de la población microbiana.

La inhibición que se presenta con más frecuencia es la causada por productos ácidos del metabolismo, que varían el pH del medio de cultivo o el estado redox de la célula. Se sabe que los iones H+ en numerosas reacciones enzimáticas pueden actuar como inhibidores no competitivos (Ginkel y Gayton, 1995; García y cols., 1998).

Ha sido referido que la cepa CBM-225 a moderadas concentraciones de sacarosa, inhibe su crecimiento (Batista, 2003), al inhibirse sus dos mecanismos de transporte y metabolismo, el sistema PEP-PTS (Saier y cols., 1993) y la exoenzima Lvs, codificada por el gen sacB (Steinmetz, 1993).

CONCLUSIONES

Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 presentó menor velocidad específica de crecimiento máxima, mayor afinidad y menos inhibición de su crecimiento por el ciclohexano con respecto a Bacillus licheniformis cepa CBM-60.

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 Autores:

Yoania Cabranes Campos1; Roberto Rafael Núñez Moreira1; Jorge Martínez Silva2; Eudalys Ortiz Guilarte1

 1 Centro de Bioproductos Marinos. Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente, Cuidad de La Habana, Cuba.

2 Facultad de Biología. Universidad de La Habana, Cuba.

Centro de Bioproductos Marinos. Loma y 37. Alturas del Vedado. Plaza de La Revolución.

Ciudad de La Habana, Cuba. Código Postal 10 600. Telef. 8811298.

 

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