INDICE
1. Introducción

2. Patogénesis de las infecciones del Tracto respiratorio inferior
2.1 Mecanismos de defensa del huésped

3. Etiología de las infecciones del Tracto respiratorio inferior
3.1.1 Neumonía adquirida en la comunidad
3.1.2 Infecciones del TRI en niños
3.1.3 Neumonía intrahospitalaria
3.1.4 Infecciones crónicas del TRI

4. Colección de muestras del Tracto respiratorio inferior.

5. Valor del frotis por Gram en secreciones del Tracto respiratorio inferior
7.1 Indice de Bartlett
7.1.1 Valoración del índice de Bartlett

6. Procesamiento de las muestras del TRI
5.1.1 Procedimiento de BAL y CEP
5.1.2 Método del Mount Sinai Hospital para lavado bronquioalveolar (BAL)
5.1.3 Método del Mount Sinai Hospital para cepillado protegido (CEP) 

7. Evaluación del cultivo bacteriano en infecciones del TRI
6.1.1 Evaluación del cultivo según el Protocolo Q- Store System

8. Infección del Tracto respiratorio inferior en pacientes inmunocomprometidos

9. Bibliografía de interés

1. INTRODUCCIÓN
“El cultivo de especimenes del tracto respiratorio inferior, puede resultar en el mayor esfuerzo innecesario que cualquier otro tipo de muestra”
Raymond Bartlett, M.D
Medical Microbiology : Quality Cost and Clinical Relevance.
1974, Edit. John Wiley & Son, New York.

Las palabras del Dr. Bartlett son tan ciertas hoy como hace tres décadas. Las enormes dificultades de obtener muestras representativas del sitio de la infección, los problemas de contaminación de las muestras, la determinación segura del agente infeccioso responsable del proceso, el valor de éstas muestras en el diagnóstico de las enfermedades respiratorias e incluso el valor de la antibioticoterapia en su control, son solo algunos de los aspectos que en mi opinión, hacen del estudio de las muestras del tracto respiratorio inferior ( TRI ), la de mayor dificultad con la que se enfrenta el microbiólogo.

Las infecciones del TRI son una de las más importantes causas de morbi-mortalidad, particularmente en niños y ancianos en el mundo. En éste sentido, la pneumonía es la principal causa de infecciones en la comunidad y la tercera causa de enfermedades nosocomiales, detrás de las infecciones urinarias y de heridas.

Debido a las características especiales de estos especimenes, se hace obligante una estandarización de los procesos diagnósticos, tal que la información generada por el laboratorio, constituya un elemento que aporte una utilidad clínica apropiada. Por lo anterior, ofrecemos a la consideración de los colegas de la microbiología el presente trabajo que pretende llenar éste cometido.


2. PATOGENESIS DE LAS INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR ( TRI ) :
Las dificultades en el aislamiento del agente etiológico de las infecciones del TRI, son un reflejo de la extraordinariamente abundante y variada flora normal de la cavidad orofaríngea. Esta cavidad puede tener un conteo de 10 ¹º a 10 ¹² UFC/ml. Son éstos microorganismos precisamente los principales responsables de la mayoría de las infecciones del TRI. Es por ello que los protocolos terapéuticos deben estar dirigidos a combatir la infección y no la colonización o la contaminación.

Para muchos de los agentes de las neumonías purulentas, la colonización del tracto respiratorio superior es seguida por la migración de los microorganismos a través de la capa mucociliar de los bronquios hacia los pulmones. La aspiración del contenido orofaríngeo, desempeña un papel importante en la patogenia de diversos tipos de neumonía. Ayudados por la gravedad y con frecuencia por la pérdida por parte del huésped de algún mecanismo protector no específico, los microorganismos alcanzan el tejido pulmonar donde se multiplican y atraen a las células efectoras. El conjunto de restos celulares y líquido contribuye a la pérdida de la función pulmonar y en consecuencia a la patología. Los agentes con cápsulas formadas por polisacáridos como Pneumococos, Klebsiella, Haemophilus, ciertos S. aureus y Criptococos , parecen ser más capaces de evadir la fagocitosis y, por lo tanto, de causar neumonía en pacientes sin una inmunidad humoral adecuada que se manifieste a través de anticuerpos específicos.

La aspiración de la flora colonizante dentro de los alveolos, es el principal mecanismo que inicia el proceso de la infección neumónica. Por lo general, antes de la aspiración, se observan cambios en la flora bacteriana menos benigna, a especies más invasivas o resistentes a los antibióticos, como ocurre con el S. pneumoniae o las Enterobacteriáceas. Hay consenso en afirmar que cualquiera invasión del árbol pulmonar, depende del balance entre los factores de virulencia, el tamaño del inóculo, de la especie aspirada , el estado del sistema inmune y la función respiratoria del paciente.

Otros mecanismos de importancia en la patogénesis lo constituyen en su orden el
aspirado de aerosoles y la transferencia vía hematógena de microorganismos a partir de un foco distante.

Sin embargo, al igual que en otros procesos infecciosos, en la cadena de la infección
neumónica se requiere un agente infeccioso, un número suficiente de éste, una puerta de entrada adecuada y un huésped susceptible. 

La colonización orofaríngea se caracteriza por factores de riesgo entre los cuales están :
a) Acidosis
b) Alcoholismo
c) Antibioterapia
d) Coma
e) Diabetes
f) Intubación
g) Sonda nasogástrica
h) Leucopenia

Una de las patologías que ha adquirido importancia a nivel del TRI, lo constituye la Fibrosis quística, una enfermedad hereditaria caracterizada por una anomalía de las glándulas que producen sudor y el moco. Es crónica, progresiva y generalmente mortal, que afecta principalmente al aparato respiratorio, el digestivo y reproductor. En éstos casos, los agentes etiológicos mayormente involucrados son el S .aureus, H. influenzae y la Pseudomona aeruginosa, sin dejar de mencionar a la B. cepacia complex y la S. maltophilia. Es interesante mencionar que las cepas de Ps. Aeruginosa, son en su mayoría fenotipos altamente mucosos, los cuales en algunos casos son sugestivos de la enfermedad. 

La patogénesis de las infecciones del TRI se caracterizan por los diversos mecanismos del agente invasor para burlar las defensas del huésped, entre ellas :

 Mecanismos para Evitar la Fagocitosis :
-- Producción de Cápsula ( S .pnumoniae, H. capsulatum, 
-- neumoniae, N. meningitidis ).
-- Producción de Toxinas ( Leucocidinas y Citotoxinas por S. aureus. ).
-- Parásitos y Hongos son más grandes que los Fagocitos.
-- Replicación dentro de la célula ( Virus y Chlamydias son 
intracelulares obligados ).

Mecanismos para Sobrevivir dentro del Fagocito :
-- Inhibición de la fusión del Lisosoma con el Fagosoma. ( Ej. T. Gondii, Aspergillus sp ).
-- Escape del Fagosoma. ( M. leprae, T. cruzi ).
-- Resistencia a la muerte en el Fagolisosoma.( Ej. M. tuberculosis, Nocardias ).
-- Crecimiento en la Célula Fagocítica.( M. tuberculosis, Legionella, Citomegalovirus ).

2.1 Mecanismos de defensa del huésped
Paralelo al inicio del proceso infeccioso, el huésped lleva a cabo una serie de medidas de defensa, entre las cuales se puede anotar :

Ø Filtración : Vello nasal, barreras anatómicas.
Ø Saliva
Ø Complemento
Ø Tos
Ø Reflejo epiglótico
Ø Interferencia bacteriana – Flora normal
Ø Sistema Mucociliar
Ø Macrófagos Alveolares
Ø Complementos
Ø Fluidos Alveolares - Defensinas, Lisosimas.
Ø Inmunidad Celular - Células B y T

3. ETIOLOGIA DE LAS INFECCIONES DEL TRI :
Las infecciones del tracto respiratorio inferior constituyen la mayor causa de muerte en el mundo y son las infecciones más frecuentes tanto en la Medicina extrahospitalaria como intrahospitalaria. Constituyen también, especialmente la neumonía, las infecciones que con mayor frecuencia son derivadas desde la atención primaria al medio hospitalario.
Hay tres microorganismos responsables del 75 % de las reagudizaciones : H. influenzae, S. pneumoniae y M. catarrhalis. El más frecuente es H. influenzae (alrededor del 50 por ciento de los casos). Las Enterobacterias y Ps. aeruginosa son menos importantes en número, aunque suelen producir cuadros más graves.

Los principales procesos infecciosos del TRI incluyen :
a) Pneumonía ( Pneumonitis ) – Inflamación del espacio y del parénquima pulmonar. ( Ej. S. pneumoniae y S. aureus ).
b) Bronquitis – Inflamación de las vías aéreas medias. ( Ej. S .pneumoniae, 
H .influenzae, M. catarrhalis, Enterobacterias ).
c) Bronquiestasia – Dilatación excesiva y daño en los bronquios. ( Ej. Fibrosis quística ).
d) Bronquiolitis – Proceso infeccioso que provoca inflamación de los bronquios.

Las dificultades en el diagnóstico de la infecciones del TRI se ven comprometidas entre otras causas por :
· El gran número de microorganismos capaces de causar enfermedad neumónica.
· Espectro clínico asociado con varios de estos agentes.
· Los procedimientos menos invasivos para el diagnóstico definitivo, son comúnmente contaminados con flora normal o no hay crecimiento del agente etiológico.
· Los procedimientos invasivos (aspirado transtraqueal, biopsia pulmonar ) son poco utilizados.
En muchos casos, la edad del paciente puede ayudar a establecer los potenciales agentes etiológicos como se describe :

Los potenciales agentes etiológicos según los procesos infecciosos son :

PNEUMONIA AGUDA
S. pneumoniae
H. influenzae
S. aureus
M. catarrhalis
L. pneumophila
M. pneumoniae
Pseudomona sp
H. capsulatum
C. neoformans
Ch. pneumoniae

BRONQUITIS
H. influenzae
H. parainfluenzae
S. pneumoniae
M. catarrhalis
Klebsiella sp
C. pneumoniae
B. pertussis
M. pneumoniae

Pneumonia por Aspiración
Peptoestreptococos sp
Fusobacterium sp
Enterobacteriaceas
Pseudomona sp
Bacterias relacionadas a pneumonia por aspiración intrahospitalaria.
Acinetobacter sp / S. maltophilia

Abscesos Pulmonares
Peptoestreptococos sp
Fusobacterium sp
Bacteroides fragilis
S. aureus
E. coli
K. pneumoniae
Ps. aeruginosa
S. pneumoniae.

Neumonía nosocomial
S. aureus ( MRSA )
S. pneumoniae
Pseudomona aeruginosa
Serratia marcescens
Acinetobacter baumannii .

3.1 Neumonía adquirida en la comunidad :
La neumonía adquirida en la comunidad constituye una causa muy importante de morbilidad y mortalidad. En los países industrializados, la neumonía adquirida en la comunidad es la primera causa infecciosa de muerte y la sexta de mortalidad general. El número de personas que fallecen cada año en el mundo como consecuencia de esta infección se cifra en aproximadamente 5 millones.

Streptococcus pneumoníae es el agente causal más frecuente de la neumonía adquirida en la comunidad , mientras que la frecuencia relativa de los demás agentes causales es variable, dependiendo del área geográfica, la población estudiada y la metodología diagnóstica aplicada. En líneas generales Mycoplasma pneumoniae y los virus respiratorios son más prevalentes en las personas jóvenes, mientras que la neumonía aspirativa es más frecuente entre la población anciana. Por su parte, Legíonella pneumophila suele afectar a pacientes adultos y Haemopliflus influenzae a adultos y ancianos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

3.2 Infecciones del TRI en niños :
Las infecciones del TRI son también de gran importancia en niños. Cada año la neumonía causa entre 750,000 –1.2 millones de muertes en neonatos en el mundo. La Organización Mundial de la Salud estima que las infecciones del TRI en niños ( 60% dividido entre S. pneumoniae/H. influenzae ) causa 4.3 millones de niños muertos en el mundo. 

Los microorganismos involucrados son :
Virus 
· Virus de la influenza A 
· Virus Syncytial Respiratorio (RSV) 
· Human Metapneumovirus 
· Varicella-Zoster Virus (VZV - chicken pox) 
Bacterias
· S. Pneumoniae 
· H. Influenzae 
· S. Aureus 
· Klebsiella Pneumoniae 
· Enterobacterias ( E. Coli ) 
· Anaerobios 
· Organismos atípicos como Mycoplasma, Legionella Pneumophila, Chlamydia sp., Coxiella Burnetii 

3.3 Neumonía intrahospitalaria :
La mayoría de los estudios consideran la neumonía nosocomial como la segunda causa de las infecciones adquiridas en el hospital. Corresponde a un 10-20% de éstas y a 5-10 casos/1000 admisiones/año. La neumonía nosocomial se adquiere a través de tres mecanismos: La aspiración, la inhalación de aerosoles y la diseminación hematógena a partir de otro foco de sepsis. Sin embargo, la microaspiración de bacterias que colonizan la orofaringe y/o están presentes en el estómago se considera el mecanismo más importante. La flora orofaríngea normal está formada principalmente por cocos grampositivos, sin embargo, la colonización de la orofaringe por bacilos gramnegativos se observa en menos del 10% de los individuos sanos, aumenta con hospitalizaciones prolongadas y alcanza el 60-75% en enfermos críticos ingresados en unidades especiales. Se define como neumonía intrahospitalaria a la infección de las vías respiratorias bajas que es adquirida por un paciente, y no existía ni estaba incubándose a su ingreso al hospital. Para su inclusión se requiere de 72 horas desde el ingreso al hospital. 
Hay distintos criterios diagnósticos para la definición de neumonías: pacientes mayores de 12 meses, menores de 12 meses y neumonías asociadas a la utilización de recursos mecánicos. Las neumonías asociadas a la utilización de recursos mecánicos se dividen en tempranas y tardías. La Neumonía Temprana es la que se produce después de las 48 a 72 hs. posteriores a la intubación de la tráquea y generalmente es el resultado de la aspiración producida en el proceso de intubación. La Neumonía Tardía es la que ocurre después de las 72 horas post-intubación endotraqueal y es generalmente causada por gérmenes resistentes tales como el Staphylococcus aureus meticilina resistente, Acinetobacter complex y Pseudomona sp, aunque los agentes etiológicos pueden ser diferentes según la institución y la población .
En gran parte las infecciones del TRI en pacientes hospitalizados son debidas especialmente a métodos invasivos :
· Intubación de la tráquea o nasogástrica.
· Inhalación de aerosoles en respiradores o anestésicos.
· Nebulizadores contaminados

3.4 Infecciones crónicas del TRI :
El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico más frecuente de infecciones crónicas del tracto respiratorio inferior, pero las micosis y las infecciones pleuropulmonares por anaerobios también pueden seguir un curso subagudo o crónico. Además del M. tuberculosis , otras mycobacterias pueden causar esta enfermedad, particularmente M. avium-intracelulare y M. kansasii. Actinomyces y Nocardia también están asociados con una aparición gradual de síntomas en las infecciones crónicas. La patogenia de muchas de las infecciones causadas por agentes que producen enfermedades crónicas del tracto respiratorio inferior está caracterizada por alguna falla en la inmunidad mediada por células del huésped o por la capacidad de estos agentes para evitar ser destruidos por los mecanismos de inmunidad mediada por células. Esta capacidad puede consistir en un efecto sobre los macrófagos debido al enmascaramiento de antígenos extraños, tamaño pequeño u otro factor que les permita vivir en los tejidos del huésped sin estimular una reacción local inmediata.

4. COLECCIÓN DE MUESTRAS DEL TRI :
Respecto a la colección de las muestras del TRI, recomendamos la Guía “ Recolección y Transporte de Muestras microbiológicas ” que hemos escrito en conjunto con el Dr. Silvio Vega, en la que se detalla los aspectos más importante a tener en cuenta en esta fase del proceso. Sin embargo, hacemos un resumen de los aspectos relevantes.

MUESTRAS ACEPTABLES
Esputo.
Aspirado traqueal/ transtraqueal.
Lavado bronquial.
Lavado bronquioalveolar.
Cepillado bronquial.
Biopsia bronquial.
Aspirado de pulmón.
Biopsia de pulmón.

MUESTRAS INACEPTABLES
Saliva.
Esputo con más de 24 h de colectado.
Hisopo.

La muestra de esputo debe ser transportada al laboratorio a la brevedad posible y procesada inmediatamente a su arribo. ( Ref. J. Clin. Microb, 2002, 40:3115-3120 ).
Muchos autores han demostrado que cuando la muestra es demorada antes de la siembra, hay pérdida de los patógenos de importancia ( Ref. Am.Rev. Dis. 125:436-442 ) y hay sobrecrecimiento de flora colonizante normal ( Ref. Appl. Microbiol.18:213-220 ).

CONSIDERACIONES GENERALES
Ø Si hay demora en el procesamiento, refrigere a 2-8 °C.
Ø Procesar todas las muestras en la cabina de seguridad.
Ø Utilice guantes y mascarillas.
Ø Las muestras colectadas con procedimientos invasivos,
Ø deben ser manejadas como muestras “valiosas” y procesadas rápidamente.
Ø Solo las muestras apropiadamente colectadas con métodos invasivos y transportadas anaerobicamente, deben ser cultivadas por anaerobios. Esto incluye: Aspirado transtraqueal, biopsia bronquial y cepillado bronquial.

a) Esputo:
· En primero lugar hay que reconocer que el cultivo de esputo por expectoración no es la muestra más apropiada para investigar infección del TRI, ya que el mismo está desacreditado, no aporta resultados definitivos y en muchos casos, son contradictorios. Muchos autores argumentan que el cultivo de esputo es un estándar imperfecto, el cual está comprometido por muchas limitaciones que afectan su especificidad y sensibilidad. ( Ref. “ Misinformation from sputum cultures without microscopic examination ”. J. Clin. Microbiol., 6:518.527
Hay estudios que concluyen que solo el 60% de los pacientes con neumonía producen esputo y de éstos más del 50% tienen cultivo de esputo negativo.( Ref. Am. Rev. Respir. Dis. 103:845-848 ). Sin embargo, por ser una muestra frecuentemente solicitada que constituye una pesada carga para el laboratorio, se hacen las indicaciones respecto a la colección de ésta muestra. 
· El paciente debe lavar sus dientes y boca con suero estéril inmediatamente antes de obtener la muestra, así se disminuye el número de bacterias contaminantes de la orofaringe. 
· El esputo debería obtenerse a primera hora de la mañana (para recoger todo el conjunto de las secreciones nocturnas, en las cuales estarán más concentradas en los microorganismos patógenos responsables del proceso infeccioso) 
· Si la producción de esputo es escasa se inducirá la expectoración con nebulizaciones de solución salina. 
Es relevante indicar que los procedimientos invasivos que a continuación se detallan, están indicados en casos de :
a) Neumonía grave que no a respondido al tratamiento inicial
b) En huésped inmunocomprometido
c ) Pacientes que no son capaces de exportar a pesar de la hidratación
d) Cuando se sospecha una infección por anaerobios donde no es útil el cultivo por expectoración
e) En la neumonía por aspiración o intrahospitalaria

b) Aspiración transtraqueal:
Los pacientes traqueostomizados son incapaces de producir un esputo en la forma normal, pero se puede recoger fácilmente las secreciones del tracto respiratorio inferior en una trampa de Lukens. Estas muestras (denominadas aspirados por traqueotomia o aspirados traqueales) deben ser tratadas como un esputo. Los pacientes con traqueotomias son colonizados rápidamente con bacilos gramnegativos y otros patógenos nosocomiales. Esta colonización per se no tiene relevancia clínica, pero estos microorganismos pueden ser aspirados y causar neumonía. Por lo tanto, tratar de establecer el agente etiológico en estos pacientes causa verdadera confusión a los microbiólogos y clínicos.

Metodología : 
· Tras anestesiar la piel de la garganta, se introduce en la tráquea una aguja y se aspiran las secreciones a través de un catéter. 
· Cualquier microorganismo aislado a partir de esta muestra se considera potencial agente causal de la neumonía. 

c) Muestras por broncoscopia
Indicaciones Diagnósticas mas comunes:
o Tos con sangre. 
o Tos persistente que no responde a tratamiento convencional. 
o Anormalidades en la radiografía del tórax. 
o Cuando se necesita analizar las secreciones y tejidos del pulmón.
o Indicaciones Terapéuticas:
§ Colocación de prótesis endobronquiales.
§ Remoción de cuerpo extraño en vías aéreas.
§ Colocación de catéter, etc

Metodología :
· Colecte el espécimen vía broncoscopio.
· El cepillado bronquial es preferido al lavado, ya que el lavado es más diluido.
· Anestesie el área con Lidocaina al 2% preferiblemente.
· Haga que el paciente inhale por la boca y exhale por la nariz.
· Lubrique ambas fosas nasales con Xylocaina en jalea.
· El paciente pudiera necesitar Demerol intravenoso para tolerar el broncoscopio.
· Lubrique el broncoscopio con Xylocaina al 2% en jalea, evitando la punta distal.
· Introduzca el broncoscopio intranasalmente.

d) Lavado bronquial :
Consiste en la instalación y aspiración secuencial de solución fisiológica ( 100 a 200 ml ) a través del broncoscopio, obteniéndose un gran volumen de muestra. 
La primera fracción es la mas contaminada y puede descartarse o bien se puede utilizar para cultivo de Mycobacterias, Legionella spp y micosis sistémica, ya que ésta tiene el mismo valor que el lavado bronquial o las secreciones traqueales para los gérmenes habituales. 

· Sujete una trampa de Lukens al broncoscopio.
· Introduzca 10 ml de solución salina no bacteriostática a través del canal abierto.
· Succione el material afuera.
· Selle el tubo de la trampa y envíe al laboratorio.

e) Cepillado bronquial
Consiste de un cepillo dentro de una doble cánula, interna y externa , para evitar la contaminación con secreciones orofaríngeas a medida que avanza el dispositivo a través del canal de succión del fibrobroncoscopio. 
Una vez ubicado éste en el sitio elegido, se avanza la cánula interna y por último el cepillo y se toma la muestra ( 0.001 a 0.01 ml ), luego de lo cual se invierte el proceso. La muestra se coloca en 1 ml de solución salina.

· Utilice un broncoscopio de doble lumen.
· Inserte la brocha citológica dentro del canal abierto del broncoscopio y avance.
· Empuje la brocha fuera de su protector y realice el cepillado.
· Jale la brocha hacia dentro de su protector y remueva la unidad de brocha completa.
· La brocha se seca al aire rápidamente lo cual es negativo para el cultivo.
· Coloque la brocha dentro del tubo de transporte conteniendo salina o
Ringer’s lactato. 
· Envíe al laboratorio inmediatamente.
· Si desea estudio por micobacterias, puede colocar la brocha dentro de un tubo conteniendo 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9.

f) Lavado bronquioalveolar
· Sujete una trampa de espécimen de 70 ml al broncoscopio.
· Introduzca 100 ml de salina no bacteriostática a través del canal en pociones de 20 ml.
· Después de la tercera o cuarta inyección de salina, reemplace la trampa de 70 ml por una de 40 ml..
· Envíe las trampas al laboratorio ó 10 ml de líquido de cada una en tubos estériles.

COMENTARIO: El mayor problema con el lavado bronquial, es la inhibición de las bacterias por la solución anestésica. El cepillado bronquial solamente obtiene 0.001 ml de muestra, por lo que la brocha debe ser rápidamente colocada en el líquido de transporte para evitar la desecación.
El lavado bronquioalveolar es preferido especialmente cuando el cultivo de esputo no ha sido satisfactorio. 
El análisis cuantitativo de la muestra por lavado, es clínicamente más relevante que el análisis de la muestra de esputo. El desarrollo de catéteres de doble lumen con tapón biodegradable evita la contaminación y permite obtener muestras de mejor calidad.
El lavado bronquioalveola r y muestras por brocha bronquial es recomendada en pacientes con sospecha de neumonía asociada a ventiladores por cultivo cuantitativo, para evaluar óptimamente el significado del organismo recuperado. 

g) Hemocultivos:
· Además de muestras de secreciones respiratorias deberían extraerse hemocultivos de todos los pacientes con sospecha de infección del TRI, ya que en un porcentaje no despreciable de casos se consigue aislar el agente causal de la neumonía a partir de la sangre del paciente. 
· Si se sospechan infecciones pulmonares causadas por virus, hongos o parásitos deben utilizarse técnicas especiales para recuperar el agente etiológico. 

5. VALOR DEL FROTIS POR GRAM EN SECRECIONES DEL TRI :
La cantidad y diversidad de flora colonizante en la cavidad orofaríngea y el árbol traqueo-bronquial, constituye el gran reto para la interpretación y reporte del frotis por Gram. La mayoría de la literatura soporta el uso clínico del frotis por Gram, 
incluso con mayor utilidad que el cultivo del TRI ( Ref. Ann. Emerg. Med. 15:325-328 ).

Numerosos estudio han mostrado que el frotis de esputo es un indicador más sensible y específico de neumonía pneumocócica y provee información útil para iniciar la terapia. Un estudios prospectivo de neumonía de la comunidad, muestra que el frotis por Gram tiene una sensibilidad del 57% y especificidad del 97% para el diagnóstico de S. pneumoniae, y sensibilidad del 82% y especificidad del 99% para la neumonía por H. influenzae ( Ref. Clin. Infect. Dis. 31:869-874 ).
Es importante tener presente, que en al caso de aspirado traqueal de ventilación mecánica obtenida de infantes recién nacidos de bajo peso, el aspirado purulento correlaciona más con la prolongada intubación endotraqueal, que con el desarrollo de síntomas respiratorios ( Ref. J. Perinatol. 21:376-381 ).

Por lo anterior, recomendamos firmemente el uso rutinario del frotis por Gram en toda muestra de esputo o secreción endotraqueal, con el fin de calificar la utilidad de la muestra. A pesar de la existencia de múltiples formas de informar el frotis, recomendamos la utilización del Indice de Bartlett para éste objetivo.
Se debe tener presente que la presencia de células cilíndricas ciliadas o células caliciformes del epitelio bronquial en muestras obtenidas por broncoscopia también indican un espécimen profundo y apto para cultivo.

EVALUACION DEL FROTIS POR GRAM 
g) Utilice objetivo de 10x para escoger el campo de estudio.
h) Concéntrece en al área con leucocitos.
i) Evite zonas de contaminación orofaríngea.
j) Haga conteo semicuantitativo de las células ( Leucocitos y células epiteliales ).
k) Haga conteo semicuantitativo de los organismos.

a) Si un organismo predomina en áreas de inflamación, haga conteo semicuantitativo y reporte.
b) Si otros tipos de bacterias están presente, haga conteo semicuantitativo del predominante y reporte.
c) Si hay diversidad de organismos y no hay organismos predominantes : Haga conteo semicuantitativo y reporte: “ Mezcla de morfotipos bacterianos” .
d) Si no hay microorganismos :
Reportar “ No se observó microorganismos”.

5.1 Indice de Bartlett :
El Indice de Bartlett es útil para valorar la calidad de la muestra de esputo. Cuente el número de leucocitos y de células epiteliales escamosas observadas en no menos de 10 campos del microscopio ( 100x ).

VALORACION:
a) Leucocitos:
10 a 25 leucocitos = 1 +
> 25 leucocitos = 2 +
b) Células epiteliales escamosas:
10 a 25 células epiteliales = - 1
> 25 células epiteliales = - 2

CRITERIO DE EVALUACION:
El índice de Bartlett se obtiene al efectuar la suma algebraica del total de leucocitos Vs células epiteliales presentes. Cualquier valor positivo es válido para aceptar la muestra como apropiada para cultivo.

5.1.1 Valoración del índice de Bartlett :

MUESTRA RECHAZADA
MAS DE 10 CELULAS EPITELIALES ESCAMOSAS POR CAMPO ( 100x )


Reportar :
“ Muestra no representativa del tracto respiratorio inferior. Enviar nueva muestra ”

TINCION DE GRAM DE ESPUTO MOSTRANDO CELULAS EPITELIALES ESCAMOSAS, AUSENCIA DE CELULAS INFLAMATORIAS Y FLORA BACTERIANA MULTIPLE.
ESTA MUESTRA NO ES INTERPRETABLE

ESPUTO DE NEUMONIA POR PNEUMOCOCOS
TINCION DE GRAM DE ESPUTO ( 100x ) MOSTRANDO ABUNDANTES CELULAS INFLAMATORIAS Y DIPLOCOCOS GRAMPOSITIVOS
INDICE DE BARTLETT : +2

6. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DEL TRI :
En primer lugar, debe descartarse toda muestra que macroscópicamente corresponda a saliva. Una tinción de Gram debe preceder en todo caso al cultivo, con el fin de asegurar la calidad de la muestra. Solo deben procesarse aquellas muestras con menos de 25 células epiteliales por campo de 100x y más de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo, en base al Indice de Bartlett.

Las técnicas de cultivo de muestras deben orientarse al aislamiento e identificación de S. pnumoniae, S. aureus, Ps. aeruginosa y Enterobacteriaceas. Se efectuará siembra de medios de cultivos sólidos tales como el agar sangre al 5% , agar chocolate y McConkey, los cuales se incubarán a 35.5 ˚C por 24 hora . Cuando se sospecha microorganismos específicos tales como Legionella ( Causa de pneumonía adquirida en la comunidad ), Mycobacterias o M. pneumoniae ( Principal causa de pneumonía atípica ), se utilizarán los medios especiales para este fin (BCYE, Lowenstein-Jensen, etc ). 

Debido a que la muestra es altamente contaminada con flora normal respiratoria, ningún medio de cultivo líquido debe ser utilizado en muestras de esputo o secreción endotraqueal, porque falsean la visión de flora mayoritaria. ( Ref. ASM- Cumitech 7B , LRTI, pag. 8, June 2004 ). Inocule los medios en el orden correcto. El menos selectivo primero ( A.S >> A.Ch >> Mc > otros selectivos ).

En las muestras por expectoración, no deben estudiarse los microorganismos anaeróbicos, los cuales son una población predominante de la flora de la cavidad oral.
La capacidad del laboratorio de obtener un diagnóstico microbiológico depende de varios factores:
· Del tipo de muestra: las obtenidas por procedimientos invasivos (BAL, CPE, y aspirado endotraqueal) son mejores que la expectoración, que está contaminada con flora bucal y no siempre es representativa de la infección pulmonar. 
· De la calidad de la muestra: que provenga realmente del tracto respiratorio inferior con escasa contaminación con flora bucal, lo que es especialmente importante en expectoración. 
· Del agente etiológico: las neumonías causadas por bacterias aeróbicas presentan mayor porcentaje de confirmación que aquellas producidas por bacterias fastidiosas o que no se desarrollan en medios de cultivo convencionales y que requieren métodos serológicos para el diagnóstico: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila. 
· Del transporte rápido y oportuno al laboratorio: Las muestra de expectoración debe ser sembrada en los medios de cultivos antes de dos horas de obtenida, de lo contrario debe utilizarse medios de transporte. 
· De la capacidad del laboratorio para reconocer una buena muestra y de establecer criterios de rechazo, cuando la calidad no es aceptable.

6.1 Procedimiento de Lavado bronquioalveolar ( BAL) y Cepillado bronquial 
protegido ( CEP) :

CULTIVO CUANTITATIVO DE BROCHAS DE BRONCOSCOPIA PROTEGIDA

Cuente el número de colonias por plato y multiplique por  el  factor de dilución 

( 100 ó 1000 )  

    COLONIAS POR PLATO       CONTEO DE COLONIAS (UFC/ML)

             < 10                                        1000

         10  a  100                             1000 a  10000

       100  a  1000                        10000  a  100000

           > 1000                                  > 100000

 Conteo de  >10 ³ /ml es significativo >> 10 ⁶/ml muestra

INTERPRETACION BROCHA BRONQUIAL PROTEGIDA
Con respecto al examen directo es fundamental que el porcentaje de células epiteliales escamosas sea < 1%, contando por lo menos 200-300 elementos entre macrófagos, células epiteliales escamosas y neutrófilos.
Si bien existe consenso internacional para considerar a 10  ufc/ml como punto de corte, algunos autores han tomado los valores de 10 ³ ó de 10  ufc/ml. 

CRITERIOS DEL INFORME BROCHA BRONQUIAL PROTEGIDA
1) Recuentos por arriba del punto de corte (10  ó 10 ³ ufc/ml respectivamente) y respuesta inflamatoria importante (>10 neutrófilos/1000x) con /sin bacterias en el examen directo 
a) Creciminento de un microorganismo: Tipificación y antibiograma 
b) Crecimiento de dos o tres microorganismos: Tipificación y antibiograma de cada uno, informe del recuento individual y del Indice Bacteriano. 

2) Recuentos "Borderline" (10 ³ y 10 ² ufc/ml ) 
a) Con respuesta inflamatoria: Tipificación y antibiograma del o los microorganismos. 
b) Sin respuesta inflamatoria: Probable contaminación. (quedan excluídos de esta consideración los pacientes neutropénicos). Evaluar factores que afectan los 
recuentos bacterianos, especialmente el tratamiento antibiótico instaurado dentro de las 24 horas de realizada la fibrobroncoscopia. Repetir muestra.

3) Recuentos bajos (10 ² y <10 ufc/ml respectivamente) con o sin respuesta inflamatoria. 
a) Cultivo negativo

NOTA: Puede procesarse por anaerobios muestras colectadas por métodos invasivos como Aspirado Transtraqueal, Biopsia Bronquial y Brocha Bronquial protegida.
No son aceptable para cultivo por anaerobios el Lavado Bronquial y Brocha no protegida. ( Ref. Essential Procedures for Clinical Microbiology. H. Isenberg A.S.M Press ).

6.2 Método del Mount Sinai Hospital en lavado bronquioalveolar 
(BAL ) :
Otro método apropiado para evaluar éstas muestras es el utilizado por el hospital de Mount Sinai en Canadá.
INDICACIONES: Util cuando el esputo falla en Identificar al agente etiológico responsable de la Neumonía o si el paciente no puede producir esputo.
MUESTRA: 15 a 30 Ml. Mantener a 4 °C si hay demora.

PROCEDIMIENTO:
1. Centrifuge a 3,500 rpm x 10 Mts.
2. Remover el sobrenadante 

GRAM: Reporte pus, organismos y si hay flora comensal.
CULTIVO: Sembrar en Agar sangre y McConkey X 48 h a 35.5 °C.

REPORTE: 
Negativo: Flora Comensal o no crecimiento.
Positivo: Cuantifique todo aislamiento significativo y reporte con su 
sensibilidad.

6.3 Método del Mount Sinai Hospital para Brocha Bronquial Protegida ( CEP )
INDICACIONES: Obtener muestra libre de contaminación orofaríngea. 

MUESTRA: Colocar la brocha en un tubo estéril con rosca y 1 Ml de Lactato de Ringer. Mantener a 4 °C.

PROCEDIMIENTO: Procesar rápidamente. Mezcle vigorosamente 
el tubo. Siembre 0.01 Ml en A.S con un asa calibrada ( Ej. de color azul utilizada en urocultivos ). Incubar en atmósfera de CO2 por 48h a 35.5 °C.

FROTIS: No procede.
REPORTE: Identifique ,cuente y haga sensibilidad de las colonias de cualquier potencial agente etiológico, según su número :
Conteos de > 1 x 10 6 L ( > 100/ml ) es significativo. Es decir más de 10 colonias en el plato primario utilizando un asa de 0.01 ml.

Nota: No procesar brochas recibidas secas o con mucho líquido.


FALSOS NEGATIVOS y POSITIVOS EN BAL y CEP

FALSOS NEGATIVOS 
ü Terapia antibiótica.
ü Incorrecta localización del broncoscopio.
ü Estadios tempranos de la infección.
ü Pobre retorno del BAL en pacientes con vías colapsadas.
ü Retardo en el procesamiento.
ü Errores metodológicos al realizar la dilución o procedimientos inapropiados.

FALSOS POSITIVOS
ü Succión de secreciones purulentas a medida que el fibrobroncoscopio avanza.
ü Anormalidades anatómicas.
ü Alta presión en las vías aéreas.

UTILIDAD DE DISTINTAS TECNICAS BRONCOSCOPICA

Nota : Escala : 1 a 3

6.4 Estudios serológicos de infecciones del TRI :
Los estudios de serológicos son generalmente reservados para patógeno anormales incluyendo Micoplasma pneumoniae , Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila, entre otros, que son difíciles de cultivar. Las contribuciones relativas de estos patógenos a las infecciones adquiridas en la comunidad, varían dependiendo de la población estudiada y de los métodos de diagnóstico usados. El diagnóstico de las infecciones causadas por estos patógeno son particularmente problemáticos, porque la presentación clínica se puede confundir con una variedad de otros agentes infecciosos, mientras que es poco sensible o lenta y requiere técnicas especializadas de cultivo. 
La prueba del antígeno de Legionella en orina, se debe realizar en casos de sospecha de la enfermedad de los Legionarios ( Paciente de más de 40 años, inmunocomprometido, o que no responde a la terapia antibiótica con - lactámicos ) o si el paciente está 

presente durante un brote de la enfermedad de Legionarios. Tiene una sensibilidad del 70 al 90% y especificidad de > 99%. Esta prueba del antígeno en orina se utiliza como prueba para Legionella serogrupo 1, que se considera el agente causante de aproximadamente el 70% de los casos divulgados de la neumonía por Legionella en los Estados Unidos. 
Recientemente, un nuevo método para la detección del antígeno del S. pneumoniae en la orina, un ensayo inmunocromatográfico ( Binax, Inc., Portland, Maine ), está ahora disponible.

Cuando se ha superado la dificultad técnica de obtener una muestra representativa del proceso infeccioso en el TRI, el laboratorio de microbiología moderno apunta hacia el uso de las técnicas de biología molecular, especialmente las sondas genéticas, con el fin de hacer más preciso el diagnóstico etiológico de éstas infecciones. 

6.5 Utilización de pruebas moleculares en infecciones del TRI :
Las pruebas de la amplificación del ácido nucleico que han sido desarrolladas por muchos laboratorios, detectan más rápidamente y con seguridad los patógenos que son difíciles de cultivar. Un sistema comercial de PCR para la detección de las infecciones respiratorias por virus está disponible como prueba para el uso en la investigación solamente . Asimismo, la detección por PCR de B. pertussis y B. parapertussis , ha demostrado ser más rápida y por lo menos equivalente al cultivo, a condición de que no se utilicen hisopos de alginato de calcio para la colección. Las pruebas comerciales aprobadas por el USDA para la amplificación del ácido nucleico para la detección directa del Mycobacterium tuberculosis de muestras respiratorias están disponibles como el AMTDT (GEN-Sondar inc., San Diego, Calif.) y el Amplicor y el COBAS (Roche molecular, Branchburg, N.J.).

7. EVALUACION DEL CULTIVO BACTERIANO EN INFECCIONES DEL TRI :
La identificación rutinaria y sensibilidad a los antibióticos debe estar limitado a uno o dos microorganismos potencialmente patógenos de muestras de cultivo cuantitativos y de 2 a 3 microorganismos potencialmente patógenos para esputo o aspirado traqueal.

La mayoría de los patógenos en las infecciones de las vías bajas están presentes en concentraciones de 1 x 106 , lo cual está representado como crecimiento moderado o fuerte en los platos primarios.

Se debe trabajar y reportar en base a un protocolo que evalúe la calidad de la muestra y los potenciales patógenos que crezcan en el cultivo.

En base a esto, el último ASM Cumitech del LRTI (ASM- Cumitech 7B, Lower Respiratory Tract Infections, June 2004 ) recomienda uno de tres protocolos para analizar éstos especimenes por posibles patógenos presente. Los protocolos están basados en la calidad de la muestra ( Gram ), la presencia de organismos y el número de patógenos presentes en el cultivo.

En base a nuestras necesidades, recursos y metodología de trabajo, recomendamos el Sistema Q-Score para ser utilizado en nuestro laboratorio.

7.1 Evaluación del Cultivo Según el Protocolo Q-Score System :
El Sistema consiste en la realización previa de un frotis por Gram ( en campo de bajo poder ) en el que se enumera el número de células epiteliales y de leucocitos 

polimorfonucleares, en base a una graduación :

1 = 1 a 9 células
2 = 10 a 24 células
3 = .≥ 25 células.

La combinación de éstos números, determina el número máximo de microorganismos que deben ser trabajados y reportados en el cultivo del TRI. 

El sistema es útil para S. aureus, S. pyogenes, H. influenzae, Enterobacteriáceas, 
M. catarrhalis, N. meningitidis. Algunos autores respetados afirman que las levaduras no son consideradas potenciales patógenos, a menos que C. neoformans sea aislado. 
( Ref. Murray et al. Mayo Clin. Proc. 52:42-45. “ Should yeasts in respiratory secretions be identificied ? ”). Las especies del género Candida rara vez dan lugar a micosis pulmonares invasoras, si no es en pacientes terminales, estando presentes en las secreciones respiratorias del 50% de la población sana y en más del 75% de los pacientes que han recibido antibioticoterapia. Está de más decir que no se debe informar crecimiento de levaduras en muestras de esputo o secreción endotraqueal, debidas casi en su totalidad a contaminación con la flora oral.

8. INFECCIONES DEL TRI EN PACIENTES INMUNOCOMPROMETIDOS :
Debido a que el sitio primario de destrucción tisular es el sistema inmune del huésped, los pacientes con SIDA tienen numerosas infecciones entre las que se destacan la neumonía, meningoencefalitis disfunción neurológica, candidiasis mucocutánea, mycobacterias, diarreas y otras infecciones sistémicas las cuales son producidas por diversos agentes : bacterias, hongos, virus y parásitos. El riesgo de neumonía bacteriana no es igual en todas las personas infectadas con VIH. El factor de riesgo más importante para la neumonía bacteriana es el grado de inmunosupresión, lo cual es reflejado en la cuenta del linfocitos- T CD4.

Las bacterias patógenas que provocan mayormente la neumonía bacteriana en pacientes con SIDA son S. pneumoniae y H .influenzae, que toman ventaja de la disfunción de las células B, mientras que los pacientes con mala función de las células T incrementan su susceptibilidad a infecciones por Salmonella sp. Se estima que entre el 10-35% de los pacientes con el virus HIV pueden desarrollar infección diseminada por H. capsulatum, si viven en áreas endémicas como la nuestra.

Todas las muestras del tracto respiratorio deben ser sembrados al menos en agar sangre y agar chocolate. En los casos de pacientes con SIDA, hay que tener presente la candidiasis oral ( CD4 T < 400 células por μl ). El frotis por Gram de exudado faríngeo solo es aceptable si el mismo tiene por objeto investigar la presencia de gran cantidad de hifas y levaduras en la cavidad oral de estos pacientes.

Hay que tener cuidado al investigar por frotis directo Histoplasma capsulatum en esputo, ya que puede confundirse la levadura con la C. glabrata que coloniza la orofarínge y el cual es similar al H. capsulatum en tamaño y forma. La pequeña célula levaduriforme del H. capsulatum ( 2-4 μm ), se observa dentro del citoplasma de macrófagos; sin embargo, C. glabrata raramente está dentro del citoplasma del macrófago. Es recomendable el cultivo o frotis directo por fluorescencia indirecta con anticuerpos.

a) Investigación por Pneumocystis carinii de aspirado traqueal o lavado bronquial: 
La biopsia de pulmón es el procedimiento a escoger. El esputo por expectoración NO es recomendable para la investigación de neumonitis por P. carinii en pacientes inmunocomprometidos por neoplasias, terapia de drogas y transplante de órganos. Sin embargo, en pacientes con SIDA los quistes están presentes con frecuencia en gran cantidad en el esputo inducido.

Se recomienda la preparación del aspirado traqueal o lavado bronquial, mezclando igual volumen del lavado y de una solución de Dithiothreitol ( Sputolysin: Calbiochem, La Jolla, Ca.). Dejar a temperatura ambiente por 15 minutos. Centrifugar a 2000 RPM por 15 minutos. Descartar el sobrenadante. El sedimento es colocado en 2 portaobjetos. Secar al aire. Fijar con formalina al 10% o metanol al 100% (Si se va a teñir con tinción de methenamina de plata de Gomori). Si se va a teñir con ortho-toluidina o con Giemsa, deje secar al aire por 30 minutos o por calor antes de teñir.

b) Biopsia de Pulmón:
Es el método convencional para el diagnóstico de P. carinii y de otros hongos oportunistas, la cual está basada en el examen histopatológico de tejido obtenido por biopsia.

El examen del microorganismos incluye microscopía de fase, Giemsa, Ortho-toluidina, Gram, Azul de Metileno, Carbolfucsina y Auramina-Rhodamina. El Wrigth y Naranja de Acridina requieren mucha experiencia para su interpretación. La tinción de Giemsa tiñe el clásico quiste con ocho cuerpos intracitoplasmáticos y también es útil si hay levaduras. Las placas son investigadas en bajo poder (x100) para descarte y en alto poder (x430) para examinar estructuras sospechosas. 

El laboratorio debe tener presente la posibilidad de infección por Mycobacterias, lo cual esta muy bien explicado en las Normas de Procedimiento para Mycobacterias. Otra posibilidad es la infección por Nocardia, en la que se observan bacilos grampositivos con apariencia de filamentos. Para ellos se recomienda la tinción de Kinyoung o de Ziehl-Nelsen modificada para actynomicetos. La nocardia puede ser aislada de los medios tradicionales por hongos (Excepto los que utilizan antibióticos) y Mycobacterias. Sin embargo en agar sangre las colonias aparecen en 2 a 7 días. El diagnóstico puede pasar inadvertido si los cultivos de esputo se desechan a las 48 horas, por lo que es conveniente que el clínico comunique al laboratorio la sospecha para una mejor evaluación de la muestra.

Otros patógenos de importancia son el Mycoplasma pneumoniae (Se requiere equipamiento especial para su cultivo) y hongos, especialmente H. capsulatum, C. 
neoformans, y Aspergillus sp, los cuales son causa frecuentes de neumonías en pacientes inmunocomprometidos.

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AUTOR:
Lic. Eric Caballero J
ecaballe@cwpanama.net
República de Panamá 
Abril de 2006