RESUMEN
Durante la germinación y los primeros días de crecimiento de la plántula, ocurren numerosos procesos fisiológicos, en los que la presencia de una sustancia tóxica o la concentración elevada de nutrientes puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal del vegetal. En este estudio se evaluó la influencia de un lodo anaerobio líquido propuesto para su uso como fertilizante en alternativa a los nocivos agroquímicos, sobre la emergencia y los primeros estadios de crecimiento de plantas terrestres, cultivadas en condiciones óptimas de crecimiento, siguiendo la normativa de OECD (Organization for Economical Cooperation and Development), en su protocolo 208 de abril 1984, modificado. Luego del tratamiento de tres grupos de plantas (sorgo, lechuga y rábano), con sustancia pura a prueba (100%) y diluciones de esta (25, 50, 75), se comprobó su inocuidad y sus potencialidades como estimulante del crecimiento. Sin embargo, el análisis morfológico arrojó que por encima del 50%, la elevada concentración de nutrientes provocó evidentes malformaciones en estructuras primordiales de los vegetales tratados.

Palabras claves: biofertilizante, evaluación toxicológica, malformaciones en estructuras primordiales. 

EVALUATION OF THE TOXICITY OF A ANAEROBE MUD IN TERRESTRIAL PLANTS
ABSTRACT 
In the plants, during the germination and the first days of growth they happen numerous physiologic events, in those the presence of a toxic substance or a high concentration of nutrients can interfere altering the survival and the normal development of vegetable. In this study, following the OECD (Organization for Economical Cooperation and Development) normative in its protocol 208 (april, 1984), was evaluated the influence of a liquid anaerobe mud proposed for its use as fertilizer in alternative to the noxious agrochemicals, on the emergency and the first days of growth of terrestrial plants, cultivated under good growth conditions. After the treatment of three groups of plants (sorghum, lettuce and radish), with the pure substance (100%) and their dilutions of (25, 50, 75), we prove their innocence and their potentialities as stimulant of the vegetable growth. However, the morphological analysis hurtled that above 50%, the high concentration of nutrients caused evident malformations in primordial structures of the treaties vegetables.
Key words: biofertilizer, toxicological evaluation, malformations in primordial structures. 

INTRODUCCIÓN
Los suelos vírgenes suelen contener cantidades adecuadas de todos los elementos necesarios para la correcta nutrición de las plantas. Pero cuando una especie determinada se cultiva año tras año en un mismo lugar, el suelo puede agotarse y ser deficitario en uno o varios nutrientes. En tal caso, es preciso reponerlos en forma de fertilizantes. Como fertilizante o abono se conoce a sustancias o mezclas químicas (naturales o sintéticas) utilizadas para enriquecer el suelo y favorecer el crecimiento vegetal.

Las plantas no necesitan compuestos complejos, del tipo de las vitaminas o los aminoácidos, pues sintetizan todos los que precisan. Sólo exigen una docena de elementos químicos, que deben presentarse de forma tal que la planta los pueda absorber. Los tres elementos que deben contener casi todos los fertilizantes son: nitrógeno, fósforo y potasio aunque en ocasiones, es preciso añadir a éstos pequeñas cantidades de boro, cobre y manganeso.

Debido al incremento en el costo de los fertilizantes químicos y a la contaminación que algunos provocan en el ambiente cuando se utilizan irracionalmente, es necesario encontrar nuevas alternativas de fertilización, económicas y más eficientes. Se considera como una alternativa viable la utilización de las fuentes orgánicas locales y regionales que tradicionalmente se han subutilizado, entre las que destacan las excretas animales.

Las excretas contienen nutrientes que los cultivos pueden utilizar, pero también poseen altas concentraciones de coliformes fecales que producen enfermedades infecciosas. Por ello, para utilizarlas como fertilizantes, es necesario darles un tratamiento de biodigestión que elimine estos agentes y se reduzca así la contaminación ambiental al convertir los excrementos en residuos útiles y sin riesgo de transmisión de enfermedades (McCaskey, 1990). 

La digestión anaerobia es un proceso complejo desde el punto de vista microbiológico; al estar enmarcado en el ciclo anaerobio del carbono, es posible en ausencia de oxígeno, transformar la sustancia orgánica en biomasa y compuestos inorgánicos en su mayoría volátiles: CO2, NH3, H, S, N2 y CH4 (Soubes, 1994). Como principales ventajas se conoce que: se optimiza el material orgánico utilizado, ya que se captan todos los productos y subproductos (gases y líquidos con sólidos disueltos) generados en la degradación, por lo cual existe poca pérdida de elementos nutritivos, cosa que no sucede en la biodegradación aerobia, y por demás los residuos orgánicos obtenidos después de la biodegradación anaerobia (efluente) tienen mayor riqueza nutricional que los obtenidos en la biodegradación aerobia (Noyola y Monroy, 1994). El efluente no posee mal olor, a diferencia del estiércol fresco, tampoco atrae moscas y puede aplicarse directamente al campo en forma líquida, en las cantidades recomendadas (McCaskey, 1990). De acuerdo con Mandujano 1981, un metro cúbico de bioabono producido y aplicado diariamente, puede fertilizar más de 2 ha de tierra por año y proporcionar hasta 200 kg N/ha de los que estarán disponibles en el primer año entre 60 y 70 kg. Además el bioabono no deja residuos tóxicos en el suelo y eleva la calidad del mismo. 

Aunque esenciales para la agricultura moderna, el abuso de cualquier fertilizante puede ser nocivo para las plantas, los cultivos y el suelo. La lixiviación de los nutrientes puede causar contaminación del agua y alteraciones como la eutrofización o desarrollo excesivo de la vegetación.

En este estudio se plantearon los siguientes objetivos: determinar los posibles efectos de la sustancia en estudio sobre la emergencia (CL50) y el crecimiento (CE50) de variedades de plantas terrestres luego de la incorporación al suelo en una aplicación única; registrar la ocurrencia o no de alteraciones de tipo morfológicas en las estructuras esenciales de las plántulas tratadas; emitir un criterio presuntivo de toxicidad del producto a evaluar. 

MATERIALES Y MÉTODOS
Los ensayos de toxicidad se realizaron en el laboratorio de ecotoxicología de TOXIMED en el período comprendido entre noviembre y diciembre de 2004.
Ensayo 1: Test de Lactuca sativa (120h de exposición)

Se realizó un ensayo de toxicidad aguda (120 h de exposición) en el que se evaluaron los efectos fitotóxicos de un lodo anaerobio líquido puro, producto de la fermentación de estiércol vacuno en el proceso de germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Se probaron un control (agua corriente pH 6,9) y 6 concentraciones: 3, 8, 20, 50, 75, 100% (tratamientos), usando como solvente agua corriente. Como puntos finales para la evaluación de los efectos, se determinó la CE/CIg 50 (concentración efectiva a la cual se produjo inhibición de la germinación al 50% respecto al grupo control); la CE/CIr 50 (concentración efectiva a la cual se produjo inhibición en la elongación de la radícula al 50% respecto al grupo control) y la CE/CIh 50 (concentración a la cual se produjo inhibición en la elongación del hipocótilo al 50% respecto al grupo control). 

Ensayo 2: Test de crecimiento de plantas terrestres (suelo natural) 
Se realizó siguiendo la metodología propuesta por la OECD (1993), en el protocolo 208 del 4 de Abril de 1984, “Ensayo de Crecimiento de Plantas Terrestres”, donde se determinaron los posibles efectos tóxicos del lodo anaerobio sobre la emergencia de semillas y sobre los estadios tempranos de crecimiento de plantas de sorgo, lechuga y rábano (seleccionadas por su importancia ecológica, económica y su elevada sensibilidad), después de una aplicación única directa al suelo. Las semillas utilizadas fueron de calidad comercial certificada, suministradas por la Empresa Provincial de Semillas Varias del MINAGRI de Santiago de Cuba. 

Se probaron un control y cuatro concentraciones: 25, 50, 75, 100% (tratamientos), en bloques aleatorios diseñados con 3 réplicas por tratamiento. En cada réplica se plantaron 10 semillas, después de incorporada la sustancia a prueba al suelo natural (sin esterilizar, pH= 7 y 3% de materia orgánica), certificado por el Instituto de Suelos del MINAGRI.

La plantación se realizó en recipientes de vidrio de 9.5 cm de diámetro x 11.5 cm de altura, se rellenaron con 500g del suelo natural, manteniéndolo a una humedad de un 60-70% de saturación. La temperatura ambiental relativa se mantuvo entre los 25 y 27ºC día/23-25ºC noche. 

En este ensayo, se determinó la CE 50 como la concentración a la cual el cambio en el crecimiento es el 50% del crecimiento del grupo control; la CL 50 como la concentración a la cual el cambio en la emergencia es el 50% de la emergencia del control. El crecimiento se expresó en términos de peso húmedo de las plantas y la emergencia se refiere a la presencia de las plántulas sobre la superficie del suelo. 

Tratamiento estadístico:
Para el cálculo de los valores medios, porcentuales y las concentraciones efectivas CE 50 y CL50 se empleó el programa Microsoft Excel. Las variables CE 50 y CL50 se calcularon a partir del estadígrafo Pronóstico el cual calcula o predice un valor futuro en una tendencia lineal usando valores existentes. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Test de Lactuca sativa (120h de exposición)
En el ensayo de toxicidad aguda basado en el test de Lactuca sativa, se obtuvo un 90 % de germinación de los controles, lo que valida la prueba.

En la dilución de la sustancia correspondiente al 3% se observó estimulación de la germinación y el crecimiento general de las plántulas tratadas. Un comportamiento similar resultó para la elongación de la radícula y del hipocótilo la exposición al 8%, ver Figura 1. 

Las principales anomalías en el sistema radicular y apical comenzaron a observarse a partir de la dilución correspondiente al 20%, siendo máximas en la mayor concentración probada. A continuación se listan las más notables.

En el sistema radicular: 
· raíces raquíticas;
· raíces atrofiadas;
· geotropismo negativo.

En el sistema apical:
· hipocótilo corto y grueso o ausente;
· hipocótilo curvado formando un lazo;
· hipocótilo retorcido formando un espiral;
· cotiledones hinchados y en ocasiones con presencia de manchas oscuras.

Estos defectos estuvieron acompañados de valores crecientes de inhibición de la elongación de la radícula y del hipocótilo. En cuanto al porcentaje de germinación la mayor inhibición ocurrió en las concentraciones superiores, ver Figura 1.

En la Figura 2 (gráficos 1; 2; 3) muestran los valores de concentración estimados, correspondientes al 50% de inhibición de la elongación radicular (CE/CIr 50), del hipocótilo (CE/CIh 50) y de la germinación (CE/CIg 50).

Figura 1. Respuesta de las semillas de Lactuca sativa frente a las concentraciones en estudio. Control; 3; 8; 20; 50; 75; 100%, de izquierçda a derecha.

Figura 2. Valores de concentración estimados, correspondientes al 50% de inhibición de la elongación radicular (CE/CIr 50), del hipocótilo (CE/CIh 50) y de la germinación (CE/CIg 50).

La Figura 3 muestra el detalle de las principales anomalías registradas.
Figura 3. Detalle de las principales anomalías. Arriba: plántula con un desarrollo normal. Debajo: principales malformaciones observadas a partir de la dilución correspondiente al 20%: 1 Geotropismo negativo; 2 Hipocótilo corto y grueso-cotiledones hinchados; 3 y 4 Hipocótilo formando un espiral. En todos los casos, raíz primaria defectuosa por atrofia y raquitismo.

Ensayo de crecimiento de plantas terrestres en suelo natural 
Al finalizar el ensayo, en la totalidad de los controles se obtuvo una emergencia igual o superior al 80% del total de semillas plantadas, con crecimiento normal y libre de malformaciones, por lo que se considera válida la prueba. 
A continuación se muestran los resultados obtenidos para cada especie en las Tablas 1 a la 6 y las Figuras 4 a la 6.
En general no ocurrieron variaciones de trascendencia en los parámetros analizados (crecimiento y emergencia) en las plántulas tratadas con respecto al comportamiento de los controles aunque los registros de malformaciones con el aumento de la concentración concuerdan con los resultados obtenidos en el ensayo 1.
Sorgo (Sorghum bicolor)
Tabla 1. Resultados del crecimiento de las plántulas de sorgo 

P: promedio del peso húmedo por concentración
C: porcentaje de crecimiento por concentración respecto al grupo control
+ estimulación

Tabla 2. Resultados de la emergencia de las plántulas de sorgo

T: total de semillas expuestas
E: total de plántulas que emergen por concentración
G: porcentaje de emergencia por concentración respecto al grupo control

Figura 4. Alteraciones morfológicas en las plántulas de sorgo. A, plántula control. B, C, D, E, plántulas tratadas (25, 50, 75, 100% respectivamente). Mesocótilo defectuoso: retorcido y en forma de lazo

Lechuga (Lactuca sativa)

Tabla 3. Resultados del crecimiento de las plántulas de lechuga

P: promedio del peso húmedo por concentración
C: porcentaje de crecimiento por concentración respecto al grupo control
+ estimulación

Tabla 4. Resultados de la emergencia de las plántulas de lechuga

T: total de plántulas expuestas por concentración
E: total de plántulas que emergen por concentración
G: porcentaje de emergencia por concentración respecto al grupo control

Figura 5. Alteraciones morfológicas en las plántulas de lechuga. A, plántula control. B, C, D, plántulas tratadas (50, 75, 100% respectivamente). Hipocótilos defectuosos: curvado o formando un lazo

Rábano (Raphanus sativus)
Tabla 5. Resultados del crecimiento de las plántulas de rábano

P: promedio del peso húmedo por concentración
C: porcentaje de crecimiento por concentración respecto al grupo control
+ estimulación

Tabla 6. Resultados de la emergencia de las plántulas de rábano

E: total de plántulas que emergen por concentración
T: total de plántulas expuestas por concentración
G: porcentaje de emergencia por concentración respecto al grupo control
+ estimulación

Figura 6. Alteraciones morfológicas en las plántulas de rábano. A, plántula control. B, C, D, plántulas tratadas (50, 75, 100% respectivamente). Hipocótilos defectuosos: gruesos y curvados.
El conocimiento de las características físicas, químicas y microbiológicas de los lodos de digestión anaerobia de estiércol vacuno es de vital importancia cuando se propone con fines agrícolas como bioabonos o biofertilizantes. De la calidad de los mismos, entre otros factores, depende el suministro adecuado de nutrientes a las plantas; por lo cual tiene una influencia directa en el desarrollo y rendimiento de los cultivos.
Los datos de la caracterización físico-química del lodo se ofrecen en la Tabla 7. 

Tabla 7. Caracterización de los lodos de digestión anaerobia. (Rodríguez S., 2004)

En el estudio bioquímico se determinó la presencia de hormonas reguladoras del desarrollo vegetal, ácido indolacético, ácido indolbutírico y ésteres de ácido indolacético, hecho reportado en la bibliografía por otros autores, para productos naturales aunque empleando otros sustratos (Rodríguez S., 2004). 

En el análisis microbiológico se determinó una población heterogénea consistente en bacterias, hongos filamentosos y levaduras. La existencia de una microflora microbiana capaz de sobrevivir en este residual resulta de importancia por su contribución al enriquecimiento de la microflora edáfica que intervienen en los procesos de descomposición del material orgánico (Rodríguez S., 2004).

El principal aporte de este producto de fermentación anaerobia es el alto contenido de Nitrógeno, Fósforo y Potasio, además la riqueza de oligoelementos como Fe, Cu, Zn, Mo, esenciales para el desarrollo de las plantas. El Nitrógeno es el componente de las proteínas y de compuestos orgánicos y favorece el crecimiento en los vegetales. El Fósforo es la parte elemental de compuestos proteicos de alta valencia e influye en la formación de las semillas y de las raíces y es el regulador principal de todos los ciclos vitales de la planta y el potasio, interviene en la síntesis de proteína y de carbohidratos, le da firmeza a los tejidos y calidad a los frutos. El Hierro, el Manganeso, el Cobalto y el Zinc intervienen en la síntesis de enzimas y el Mo es de vital importancia para que se efectúe la fijación biológica del Nitrógeno atmosférico. 

El azufre (en forma de iones sulfatos) es uno de los elementos bioenergéticos indispensables para el crecimiento y desarrollo de las plantas, su rol es importante porque forma parte de las albúminas y porque activa los procesos enzimáticos, las funciones hormonales la formación de clorofila y forma parte de los glucósidos y algunos ácidos grasos de ciertos vegetales, su deficiencia en el suelo puede provocar fundamentalmente clorosis y afecta el crecimiento normal de las plantas. Los lodos evaluados presentaron un promedio de sulfatos de 4,8 % el cual resulta de interés agronómico por las razones anteriormente expuestas.

Todos estos nutrientes son necesarios para el crecimiento y desarrollo de los procesos fisiológicos, para la microflora edáfica que intervienen en la descomposición de la materia orgánica en el suelo, la fijación del Nitrógeno atmosférico y la solubilización del fósforo; procesos vitales que mantienen un equilibrio en el suministro constantes de nutrientes a las plantas. 

Los concordantes resultados obtenidos de ambos ensayos muestran que aunque la fermentación anaerobia de la materia orgánica produce un residuo no tóxico y de excelentes propiedades fertilizantes a competir o complementarse con los agroquímicos en cultivos de alto rendimiento: plantas ornamentales, flores de corte, plantas en maceta, hortalizas en sistema de producción intensiva en campo, en invernaderos y en hidroponía, elevando la calidad del suelo, siempre que sea posible deben realizarse estudios experimentales de laboratorio y de campo para poder tomar en cuenta los efectos residuales de los nutrientes en el crecimiento de los cultivos y a la hora de formular las recomendaciones en materia de diluciones, ya que el exceso de algunos de estos constituyentes puede manifestase en signos de toxicidad como los que se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Signos de toxicidad reportados por exceso de algunos nutrientes 

<http://www.new-plant.com.ar/infonewplant/Info_NewPlant_No1.pdf.>

Es conveniente señalar que aunque en este estudio se analizaron solamente las primeras etapas de crecimiento, los criterios antes expuestos se toman como regla general en el afán de aplicar una fertirrigación adecuada para obtener plantas sanas, de alta calidad y que satisfagan las expectativas de todos, además de la protección del medio ambiente. También es importante considerar la ventaja económica adicional para los productores que representa la dilución, al poder fertilizar más con menos cantidad de producto que se extraiga del digestor.

CONCLUSIONES 
Teniendo en cuenta los resultados observados en el estudio en suelo natural podemos concluir que el producto posee un escaso poder inhibitorio sobre la emergencia y los primeros estadios de crecimiento de las plántulas tratadas aunque las diluciones por encima del 50% pueden inducir alteraciones de tipo morfológicas en estructuras primordiales, comprobándose la sensibilidad de estas a la concentración excesiva de nutrientes, por lo que de manera general el efecto fitotóxico comienza a considerarse a partir de esta dilución.

RECOMENDACIONES 
Recomendamos su aplicación en diluciones inferiores al 50%, estudiando los requerimientos nutricionales del cultivo vegetal donde se vaya a aplicar; igualmente la realización de estudios de campo para aumentar los datos referentes a la actividad del producto en el ambiente natural con el empleo de estas y otras especies vegetales.

REFERENCIAS 
Mandujano M., I. 1981. Biogas: Energía y fertilizantes a partir de desechos orgánicos. Manual para el promotor de la tecnología. Organización Latinoamericana de Energía. Cuernavaca, Morelos, México.
McCaskey, A.T. 1990. Microbiological and chemical pollution potential of swine waste. pp. 12-32. In: Memorias del Primer Ciclo Internacional de Conferencias sobre Manejo y Aprovechamiento de Estiércol. CINVESTAV. Guadalajara, Jal., México.
Rodríguez Pérez Suyén et al. 2004. Caracterización de lodos aerobios líquidos. Universidad de Oriente. Facultad de Ciencias Naturales. Centro de Estudios de Biotecnología Industrial.
OECD Organization for Economical Cooperation and Development 1993. Guidelines for testing of chemicals 208 Adopted 4 April 1984.
Soubes, M. 1994. Biotecnología de la digestión anaerobia. pp. 136-148. In: III Taller y Seminario Latinoamericano “Tratamiento de Aguas Residuales”. Montevideo, Uruguay. Tchobanoglous, G. y E.D. Schoeder. 1985. Water quality: Characteristics, modeling, modification. Addison-Wesley. Reading, MA.
Noyola A. y Monroy O. 1994. Experiencias y expectativas del tratamiento de residuales porcinos en México. Universidad Autónoma Metropolitana. Iztapalapa. pp. 331-340. In: III Taller y Seminario Latinoamericano “Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales”. Montevideo, Uruguay.
Info New Plant. Diciembre 1998. Los síntomas foliares de deficiencias de nutrientes. Disponible en: http://www.new-plant.com.ar/infonewplant/Info_NewPlant_No1.pdf. Leído 2 de septiembre de 2005.

AUTORES
*Lic. Patricia Aportela Gilling (1), 
Lic. Yuleidis Gonzáles Pérez (2), 
Tec. Ebert Marcos Albear (3), 
Tec. Irela Pérez Andrés (4), 
M.sc. Suyén Rodríguez (5), 
Lic. Adis Terry Brown (6).

(1) (2) (3) (4) Centro de Toxicología y Biomedicina (TOXIMED). Instituto Superior de Ciencias Médicas Santiago de Cuba. 
Autopista Nacional Km 1½
Código Postal 90400. Apartado Postal 4033. Santiago de Cuba.
Tel.: (53) (22) 64 3796, 64 3926, 64 4095
Fax: (53) (22) 68 7188
e-mail: aportela@toxi.scu.sld.cu, patriciaaportela@yahoo.es

(5) Centro de Estudios de Biotecnología Industrial (CEBI). Universidad de Oriente. Santiago de Cuba.
Patricio Lumumba s/n.
CP: 90 500. Santiago de Cuba.
Tel.: 63 2095
Fax: 632689