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El Postgrado en el extranjero: memorias de un Mexicano

Resumen: No es sino a partir del año 1984, durante mi estancia en Francia como estudiante del diplomado de estudios avanzados en tecnología y con equivalencia al Doctorado en Ciencias, Especialidad en Biotecnología ( Universidad de Tecnología de Compiegne); cuando entro por primera vez en contacto con los polisacáridos parietales de vegetales.
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Autor: Dr. Mauricio Alfredo Ondarza Benítez

No es sino a partir del año 1984, durante mi estancia en Francia como estudiante del diplomado de estudios avanzados en tecnología y con equivalencia al Doctorado en Ciencias, Especialidad en Biotecnología ( Universidad de Tecnología de Compiegne); cuando entro por primera vez en contacto con los polisacáridos parietales de vegetales.

Despierta entonces mi interés por conocer aspectos relacionados a sus propiedades. Bases de datos relacionadas a su origen, naturaleza química, su clasificación y las técnicas cuali y cuantitativas para su análisis, conceptos sobre viscosidad, comportamiento reológico, fluidos newtonianos, etc.; comienzan a martillar mi cabeza día a día.

Enseguida me entero que estos polímeros naturales guardan una variada composición química que los caracteriza, por la presencia de grupos radicales de substitución con carga aniónica y catiónica. También se habla de elementos anfóteros y además de los que son neutros.

Debido a éstos aspectos bioquímicos, surge el concepto de conjugar a los polisacáridos con colorantes químicos que faciliten su análisis cuantitativo. Aquí aparece el Alcian Blue como colorante específico de polisacáridos de microalgas.

Bueno, cabe señalar que el interés en mi primera experiencia de investigación; estriba en establecer una relación entre la función y la estructura de los metabolitos en cuestión. Para ello, es necesario conocer la fisiología del responsable de la síntesis biológica de los polisacáridos. 

Se trata de la microalga rodofícea Porphiridium cruentum (purpureum), perteneciente al Orden de los Porfiridiales. Esta además de su biomasa típica, secreta metabolitos secundarios con un alto valor agregado en la industria de los ficocoloides como: espesante en alimentos, medio de cultivo de bacterias, etc.

Su hábitat es el mar y su división celular es similar a la de microorganismos como las levaduras y las bacterias. Se le cultiva en condiciones batch y continuo, con tiempos de multiplicación de 14 días y de 16 horas, respectivamente.

Desde el punto de vista biotecnológico, el laboratorio de Bioenergía Solar, ubicado dentro del Centro de Estudios Nucleares en la ciudad de Cadarache, al norte de Francia; decide aplicar una estrategia de inmovilización de las células vegetales unicelulares en cuestión y de evaluar una posible liberación de los polisacáridos al sobrenadante. Parámetros de su cultivo tales como: la calidad y cantidad de la intensidad luminosa que favorezca el desarrollo celular y la biomasa de la microalga; la concentración óptima de los nutrientes esenciales que requiere esta; el suministro del dióxido de carbono enriquecido en el aire de alimentación en los cultivos; son algunos de los parámetros que se monitorean con el fin de establecer un equilibrio entre las necesidades fisiológicas de los organismos vegetales (fotosíntesis, respiración celular) y la síntesis de compuestos ricos en energía.

A lo largo de 9 meses, mi labor se centra en la aplicación y el aprendizaje de metodologías que permitan evaluar la eficiencia del cultivo In vitro, tanto en condiciones estacionarias como en continuó.

Es de esta manera como me inicio en el campo de las técnicas de espectroscopia de emisión de absorción molecular visible. Las moléculas presentan en general una absorción que es la suma de las absorciones de los diferentes grupos radicales que los conforman: Ciertos grupos llamados cromóforos, son responsables de una absorción intensa dentro de la región visible y ultravioleta por efecto de las radiaciones electromagnéticas.

Por ejemplo; la formación del oxigeno liberado por la reacción de la fotosíntesis, puede ser medido mediante un electrodo polarográfico de Clark. La intensidad dependerá de la concentración del oxigeno en la solución interna, y por ende del oxigeno ambiental.

El crecimiento de la biomasa se evalúa por la absorción a una determinada longitud de onda y las medidas de la variación de la densidad óptica de la solución de interés (el comportamiento surge de la ley de Beer-Lambert). Un espectrofotómetro nos facilita dichas mediciones.

En lo que respecta a la determinación de la concentración celular y del volumen celular promedio de las células en suspensión; se obtiene un histograma de la repetición de las células en función de su diámetro, mediante un contador coulter 7M. Alícuotas provenientes de los cultivos son inmersas en electrolitos, en donde un campo eléctrico aplicado provoca un desplazamiento de los iones (es la ley de Faraday la que rige en este caso la conducción de los llamados electrolitos).

Finalmente mencionaré el uso de viscosímetros; de electrodos de pH; de microscopios de transmisión y de barrido; de debímetros con mezclas gaseosas; de métodos de adsorción o prepolimerización entre los biocatalizadores y espumas o resinas de poliuretano del tipo HYPOL 3000 y PE 237.2; intensidad luminosa medida en watts/ m2 ; para las lámparas del tipo Gro-lux o Cool-white; y de cilindros en vidrio del tipo Air-lift para llevar a cabo los cultivos en fase estacionaria o continua. 

Posteriormente, es durante mis estudios del doctorado que decido continuar mi especialización en temas relacionados con la implementación de condiciones controladas de cultivos con el objeto de lograr orientar el metabolismo en talofitas macroalgas del orden Gigartinales; de manera a favorecer la biosíntesis de galactanos a nivel de la pared celular.

Los estudios realizados por mas de 2 años y medio, me permiten aprender técnicas de análisis estructural de los polisacáridos que logran ser extraídos con mezclas de solventes orgánicos miscibles en agua y a diferentes temperaturas; a partir de diferentes partes de la macroalga ( eje central, ramificaciones primarias y secundarias) que representan diferentes edades en la planta.

Es así como gracias al empleo de una derivatización de carbohidratos ( es decir formación de acetatos de alditol ) y de un análisis cuali y cuantitativo por cromatografía en fase gas-líquido y con detector de ionización por flama; se logra establecer que las partes mas jóvenes del vegetal, están constituidas principalmente por residuos glucídicos (A-B)n alternados y con pocos grupos de sustitución. 

Por el contrario, son las partes más maduras del vegetal, las que presentan una sustitución lateral en la unidad D-galactosa de la cadena polimérica; por residuos de azúcares metilados (4-0-metil-L-galactopiranosa).

Las implicaciones metabólicas de ésta nueva configuración estructural nos conllevan a preguntar ¿si éste fenómeno es el efecto del anabolismo o es el resultado de una degradación, seguida por una biosíntesis de novo de polímeros más o menos sustituidos? Al parecer, un aislamiento de las enzimas que participan en éstos eventos, arrojarían respuestas a nuestra hipótesis de investigación establecida.

Parte de los métodos de aislamiento y de extracción de heteropolímeros, hacen referencia a un proceso inicial de la solubilización del polímero que tendrá una localización celular específica (en la pared celular, como material estructural primario o dentro de la matriz citoplasmática asociada).

Su fraccionamiento en moléculas de menor tamaño molecular y con características de carga específicas del género y especie celular; se llevan a cabo mediante técnicas cromatográficas de intercambio iónico (DEAE-Sephadex A-50, DEAE-Sepharose CL 6B, DEAE-celulosa, etc...).

El análisis estructural de éstos fragmentos puede obtenerse de manera no destructiva por técnicas como la Resonancia Magnética Nuclear del 13C o del 1H (protón). Métodos espectrofotométricos clásicos efectúan una hidrólisis ácida de las muestras y que por descomposición dan lugar a los cromógenos (generalmente derivados furanos o pirrólicos) los que se condensan con reactivos específicos que producen productos con coloración.

Esta puede entonces ser medida en el espectro de absorción en la región visible, ultravioleta o infrarroja del espectro luminoso. Un inconveniente estriba en que éstos métodos son empíricos pues requieren de una calibración con compuestos puros conocidos y a menudo no logran establecer diferencias enantioméricas (posición Dextrógira o Levógira) entre los miembros de una misma clase de compuestos glucídicos.
Dentro de los métodos más comúnmente utilizados tenemos:

a) antrona ácido sulfúrico
b) fenol-ácido sulfúrico

Otra técnica es la de la pirrólisis acoplada a la cromatografía de gases y espectrometría de masas.

De manera preparativa, se cuenta también con la cromatografía de líquidos a altas presiones o resoluciones. Es así que mediante análisis conocidos de metilación, se logra establecer el tipo de anillo del carbohidrato (furano o pirano), la configuración anomérica del enlace glucosídico (α o β), así como del tipo de enlace o el sitio de sustitución (3,6-anhidro-α-L-galactosil(1-3),β-D-galactopiranosa) unidad polimérica de repetición de la fracción neutra (agarosa) del galactano presente en la macroalga rodofita Gracilaria verrucosa y otras.

En Octubre de 1988, presenté el exámen de disertación en la Universidad de Tecnología de Compiegne, Francia. Esta vez estudié y preparé muy bien mis resultados y logré con ello una calurosa y sincera felicitación por parte de los sinodales. Un año después me ví en la necesidad de buscar empleo y conseguí incorporarme a un Centro de Investigación Biomédica orientada al estudio de las enfermedades infecciosas y en particular al análisis molecular de la relación huésped-parásito.

Mi primera lectura proviene de la revista: Annual Review of Biochemistry y para mi satisfacción me entero sobre la existencia de compuestos glicoconjugados (carbohidratos unidos covalentemente a proteínas, lípidos o a pequeñas péptidos). La curiosidad y las ansias por entender todo acerca de los compuestos biológicos que juegan papeles importantes en diversos aspectos como: la nutrición, inmunología, la glicosilación de las proteínas, la síntesis de oligosacáridos, la Salud, la Biología Animal y Vegetal.

En fin, es así que nace una nueva Ciencia llamada Glicobiología: Historia bioquímica de los glicoconjugados. Su revisión y estudio es presentado en la revista BIOFUTUR (Biología general de los carbohidratos) y es digna de ser compilada y traducida para su divulgación en la versión castellana.

Mientras tanto, quisiera comentar que a través de las actividades cotidianas en las que me involucré a lo largo de 6 años de estudios, investigación y trabajo experimental; desarrolladas dentro del Instituto Nacional de Salud Pública (Centro de investigaciones sobre Enfermedades Infecciosas) ubicado en la Ciudad de Cuernavaca, Estado de Morelos (desde Noviembre de 1989); logré publicar en la revista Biomedical Chromatography, parte de mis hallazgos.

A continuación se incorpora el siguiente texto compilado de la revista BIOFUTUR (Julio-Agosto de 1993) extraído de la Editorial escrita por Annette Millet, redactora en jefe; bajo el título: Las Glicotecnologías: ¿Un nuevo desafío?

La Glicobiología es una ciencia relativamente nueva que empieza a tomar distancias. Pierre Tambourin, Director de Ciencias de la Vida en el Centro Nacional de Investigación Científica en Francia (CNRS), recién la incluye en temas primordiales de investigación. 

Los japoneses han logrado después de varios años, establecer un vasto programa sobre el tema de los glicotecnologías. Numerosos investigadores comienzan a descubrir el papel informativo de los glúcidos que tiempo atrás era promovido por otros investigadores.

Sin embargo, no son ni el papel de los glúcidos como determinantes de los grupos sanguíneos, ni tampoco el papel de la heparina en la coagulación de la sangre o la importancia de los oligosacraidos en la nutrición animal y humana; los factores que han colocado a la Glicobiología, al frente del escenario. El detonador ha provenido nada menos que de la ¡Biología Molecular y de la Ingeniería Genética!

En efecto, ha sido la producción de proteínas mediante la recombinación genética, la que ha logrado alcanzar el interés en la investigación de la s glicoproteínas al poner en relieve la importancia de los glicanos y de sus funciones biológicas por largo tiempo ignoradas o rechazadas.

Por ejemplo, la clonación de proteínas de origen humano y en organismos eucariontes, en diversos sistemas huésped, muestra que los productos obtenidos pueden ser identificados por su patrón de glicosilación que trae como resultado modificaciones considerables en la actividad biológica.

Los trabajos realizados sobre el tPA (activador tisular del plasminógeno) y la EPO (eritropoyetina) son los mejores ejemplos. Tan es así que recientemente se entabló una demanda en torno a la patente de éste último (Amgen y el Instituto Genético).

El número especial de la revista BIOFUTUR, ilustra diferentes aspectos referentes a ésta interesante disciplina. La introducción corre a cargo del Profesor Jean Montreuil quién narra la manera en que se han ido descubriendo las funciones informativas de los glúcidos; presenta así mismo, las diversas funciones biológicas de éstos y aborda la descripción de sus estructuras bioquímicas.

La gran diversidad de las estructuras glicánicas, las coloca como candidatas de selección , multiplicidad de fenómenos de reconocimiento celular sustrato-célula y célula-célula. Es así como Michel Masigny lo demuestra en el campo de la biología animal; Jean-Claude Prome y Nathalie Demont en la biología vegetal y Pierce Monson en la nutricion humana y animal.

La actividad biológica de los carbohidratos y sus aplicaciones, son ilustradas en el tema de las vacunas y de la inmunologia por Jean Michel Fournier y por Arlette Adam. 
André Ververt por su parte nos explica que si la función precisa de un glicano depende estrictamente de su estructura; entonces todo el problema relacionado con las proteínas recombinantes reposa en la capacidad de las células huésped, por producir copias fidedignas de la glicoproteína natural y ¿ Qué hay sobre el control de los mecanismos de glicosilacion de éstas?.

Lo que caracteriza a las estructuras glicánicas, es su exetrma diversidad. El conocimiento sobre la relación estructura-función de los glicanos, la necesidad de establecer una identificación de las moléculas, requiere de medios tecnológicos adecuados para definir perfectamente dichas estructuras.

Gérard Strecker enfatiza los avances y los obstáculos presentes en el análisis estructural. Posteriormente Joachim Thiem describe la manera en la que combinando con juicio la síntesis química con la enzimatica; se pueden producir grandes cantidades de oligosacáridos complejos.

Finalmente, Stéphane Altaba comenta como en el Japón, tanto los políticos, académicos e industriales; se organizan para hacer de las glicotecnologías un reto mayor a lo largo del siglo XXI.



Lecturas bibliográficas complementarias.


BIOFUTUR (1993). Spécial. La Biologie des Sucres (Sommaire, No. 125, Juillet-Août, pages 1-90.

Ondarza, M. and F. Sotelo. (1996). Biomedical Chromatography, 10: 6-10.

Karlsson, K.A. (1989). Annu Rev Biochem. 58, 309-358.

Ondarza, Mauricio. (1988). Etude des galactanes extraits de la paroi de l’algue agarophyte Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenfuss cultivee en conditions controles. Diplome D’Etudes et de Recherche en Technologie. Thése U-05. Université de technologie de Compiegne, France. Pages 1-88.


Autor:
Dr. Mauricio Ondarza Beneitez

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